本发明涉及基因工程，具体涉及莱鲍迪苷a糖基转移酶cvsugt76突变体及其应用。
背景技术：
1、健康膳食、低糖饮食的饮食观念越来越受到市场和消费者青睐和重视。人工和天然代糖作为食品添加剂的甜菊糖苷是一种是无毒、无致癌物，是一种安全可以替代蔗糖的理想天然代糖，甜度是蔗糖200～300倍。而莱鲍迪苷a(rebaudioside-a，reb a)是巴拉圭菊科多年生草本植物甜叶菊中发现的双萜类化合物。reb a是甜菊苷类代表性无毒的药用天然甜味剂，高纯度reb a其甜度约为蔗糖300～400倍。reb a具有调节血糖平衡、调节心血管和降低高血压的作用。且有相关文献报道证明无基因毒性和癌变诱导性。目前甜菊糖苷类化合物已经被作为药用的天然甜味剂被美国(fda)、欧盟食品安全局(efsa)，以及我国卫健委先后批准用于糖果、糕点、可可制品的食品饮品生产中。相较于甜菊糖苷混合物，高纯度的reb a无明显后苦味，且甜味高于一般甜菊糖苷提取物。目前各国对于甜菊糖苷甜味剂其最大使用量是以甜菊醇作为当量计算。因此高纯度reb a在生产过程相较于甜菊糖苷混合物有着稳定的甜度和风味，具有较高的附加值和市场应用前景。
2、为了提高高纯度莱鲍迪苷a的产量，国内外已开展研发微生物异源合成法，期望获得高纯度莱鲍迪苷a作为产品或者作为下游莱鲍迪苷d和莱鲍迪苷m合成的反应底物。目前已知野生型糖基转移酶cvsugt76以甜菊糖苷和udp-g(尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖)为底物催化合成莱鲍迪苷a，但是其转化效率仍不能满足工业要求，因此有必要开发新的催化酶或者工程菌株以满足莱鲍迪苷a工业化生产的需要。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是：如何实现高纯度莱鲍迪苷a工业化生产。
2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供蛋白质，所述蛋白质为糖基转移酶cvsugt76突变体，所述糖基转移酶cvsugt76突变体选自下述任一种蛋白质：
3、a1)、名称为y157h/p264h的蛋白质，其氨基酸序列是seq id no.3；
4、a2)、名称为p264h的蛋白质，其氨基酸序列是seq id no.2；
5、a3)、a1)或a2)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与糖基转移酶相关的蛋白质；
6、a4)、在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。
7、其中，seq id no.3和seq id no.2分别由465个氨基酸残基组成。
8、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
9、所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。
10、第二个方面，本发明提供与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料选自下述任一种：
11、b1)、编码上述蛋白质的核酸分子；
12、b2)、含有b1)所述核酸分子的表达盒；
13、b3)、含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
14、b4)、含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
15、b5)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
16、b6)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有b3)所述重组载体的转基因植物组织；
17、b7)、含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有b3)所述重组载体的转基因植物器官。
18、进一步地，所述的生物材料中，b1)所述的核酸分子选自下述任一种：
19、g1)、编码链的编码序列是seq id no.5或seq id no.4所示的dna分子；
20、g2)、编码链的核苷酸序列是seq id no.5或seq id no.4所示的dna分子；
21、g3)、与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述蛋白质的dna分子。
22、本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
23、本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
24、第三个方面，本发明提供一种制备重组菌的方法，所述方法包括将编码上述蛋白质的核酸分子导入受体菌中获得所述重组菌。
25、进一步地，所述的方法，所述受体菌为大肠杆菌。
26、进一步地，所述的方法，所述的核酸分子选自下述任一种：
27、g1)、编码链的编码序列是seq id no.5或seq id no.4所示的dna分子；
28、g2)、编码链的核苷酸序列是seq id no.5或seq id no.4所示的dna分子；
29、g3)、与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述蛋白质的dna分子。
30、第四个方面，本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达上述的蛋白质。
31、进一步地，所述重组大肠菌通过将编码上述蛋白质的核酸分子导入受体大肠杆菌中获得。
32、进一步地，所述重组大肠中，所述核酸分子通过重组载体导入受体大肠杆菌中，所述重组载体可为原核表达载体。在本发明的一个实施例中，所述原核表达载体为pet32a-cvsugt76(y157h/p264h)或pet32a-cvsugt76(p264h)。
33、第五个方面，本发明提供一种菌剂，所述菌剂包括上述的重组大肠杆菌或/和包括上述的重组大肠杆菌的培养物。
34、第六个方面，本发明提供上述的蛋白质或上述的生物材料或上述的重组大肠杆菌在c1)或c2)中的应用，
35、c1)、在生产莱鲍迪苷a中的应用；
36、c1)、在制备生产莱鲍迪苷a的产品中的应用。
37、进一步地，上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。
38、进一步地，上述应用中，所述产品可为蛋白质试剂、重组表达盒、重组载体、重组菌或菌剂或重组菌的培养物。
39、第七个方面，本发明提供一种制备莱鲍迪苷a的方法，所述方法包括使用上述的蛋白质或上述的生物材料或上述的重组大肠杆菌催化甜菊糖苷和尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖，得到莱鲍迪苷a。
40、本发明中，所述甜菊糖苷使用购自诸城市浩天药业有限公司，货号stv-80m20220109的stv-80，实施例中简称为stv-80。所述尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖使用购自上海麦克林生化科技股份有限公司，货号为u850073的二磷酸尿苷葡萄糖二钠盐，简称为udp-g。
41、在本发明的实施例中，催化甜菊糖苷和尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖，得到莱鲍迪苷a的反应体系有：1)在50ml三角瓶中加入20ml的反应混合物(包含5.5g/l stv-80、10g/l udp-g，溶剂为水)、加入1.2制备的重组菌株e.coli bl21/pet32a-cvsugt76(y157h/p264h)菌体沉淀1g，然后分别用50mm磷酸钠缓冲调节混合物的ph至7.5，在35℃180rpm条件下进行反应。2)在50ml三角瓶中加入20ml的反应混合物(包含12g/l stv-80、16g/l udp-g，溶剂为水)、加入1.2制备的重组菌株e.coli bl21/pet32a-cvsugt76(y157h/p264h)菌体沉淀2g，然后分别用50mm磷酸钠缓液冲调节混合物的ph至7.5，在35℃180rpm条件下进行反应。
42、本发明成功挖掘表达洋蓟来源的糖基转移酶类似蛋白及其突变体并进行功能鉴定。同时成功构建了大肠杆菌工程菌株对甜菊糖苷类化合物鲍莱迪苷ra的活细胞催化反应的应用。
43、本发明中的糖基转移酶cvsugt76突变体，是将cynara cardunculus来源的糖基转移酶cvsugt76(ncbi登录号xm_025137648.1野生型序列对应的氨基酸)的第157位酪氨酸和/或264脯氨酸进行突变后获得的突变体。
44、本发明对来源于cynara cardunculus的糖基转移酶cvsugt76进行改造，对糖基转移酶cvsugt76的第157位酪氨酸和/或264脯氨酸进行定点突变，得到了催化效率提高单突变体和双突变体。
45、本发明还提供了上述糖基转移酶cvsugt76突变体的制备方法，将seq id n0.1所示的糖基转移酶cvsugt76的氨基酸序列中第264位脯氨酸突变为组氨酸，和/或将第157位酪氨酸和264脯氨酸突变为组氨酸。
46、在本发明的其中一种优选的实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示的糖基转移酶cvsugt76的氨基酸序列的第264位脯氨酸(pro)突变为组氨酸(his)，获得序列如seq id no.2所示突变体，命名为cvsugt76(p264h)。
47、在本发明的其中一种优选的实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示的糖基转移酶cvsugt76的氨基酸序列的第157位酪氨酸(tyr)突变为组氨酸(his)，第264位脯氨酸(pro)突变为组氨酸(his)，获得序列如seq id no.3所示突变体，命名为cvsugt76(y157h/p264h)。
48、与现有技术相比，本发明具有如下优点：
49、(1)、本发明构建pet32a(+)大肠杆菌表达系统用于表达cynara cardunculus来源的糖基转移酶cvsugt76以及其突变体，解决了原核表达系统中ugt家族过表达问题。
50、(2)、本发明构建的基因工程菌可以在-20℃或-80℃保存，反应中使用bl21(de3)基因工程菌进行酶的表达，并完成了活细胞反应催化过程，简化了反应工艺过程，可用于实际生产。
51、(3)、本发明构建的表达糖基转移酶突变体的重组菌在催化甜菊苷生成莱鲍迪苷a中的产量比表达糖基转移酶野生型的重组菌提高了约8.5倍，在最适反应条件下，莱鲍迪苷a转化率可达到93.5％。
1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为糖基转移酶cvsugt76突变体，所述糖基转移酶cvsugt76突变体选自下述任一种蛋白质：
2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料选自下述任一种：
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：b1)所述的核酸分子选自下述任一种：
4.一种制备重组菌的方法，其特征在于：所述方法包括将编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子导入受体菌中获得所述重组菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述的核酸分子选自下述任一种：
7.一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌表达权利要求1中所述的蛋白质。
8.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂包括权利要求7中所述的重组大肠杆菌或/和包括权利要求7中所述的重组大肠杆菌的培养物。
9.权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料或权利要求7或8所述的重组大肠杆菌在c1)或c2)中的应用，
10.一种制备莱鲍迪苷a的方法，所述方法包括使用权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料或权利要求7或8所述的重组大肠杆菌催化甜菊糖苷和尿嘧啶核苷-5'-二磷酸葡萄糖，得到莱鲍迪苷a。
