本发明属于酶催化，具体涉及一种胺脱氢酶、基因、重组菌、胺脱氢酶粗酶液、脱氢酶组合物、脱氢酶粗酶液组合物和制备(r)-3-氨基丁醇的方法。
背景技术：
1、度鲁特韦是一种人类免疫缺陷病毒类型1(hiv-1)整合酶链转移抑制药(insti)，与其他抗逆转录病毒药联和用于治疗hiv-1感染。临床前研究结果显示其毒性小，无基因毒性和致癌毒性，且在大于临床剂量27倍时未见明显的生育毒性和致畸毒性。该药物于2013年获得美国食品药品监督管理局批准，于2014年被欧盟委员会批准在整个欧盟使用。
2、(r)-3-氨基丁醇是制备度鲁特韦药物的核心中间体，市场需求量500吨以上。近年来，通过化学或生物催化方法已经开发了许多合成高纯度 (r)-3-氨基丁醇的策略。化学方法，如动力学拆分和手性来源的还原，需要昂贵的过渡金属催化剂、复杂的保护和脱保护条件以及高压设备。相比较传统的化学方法，生物催化具有温和的反应条件，减少了环境的影响，是一种更具经济性、更环保的合成技术，除此之外还有很强的对映选择性。转氨酶催化4-羟基-2-丁酮的不对称还原胺化，因其高立体选择性和高原子效率被认为是一种有效的方法。但转氨酶存在一些缺点，如转氨酶需要辅酶磷酸吡哆醛参与转氨基作用，此辅酶成本较高；转氨酶的底物结合区域具有特殊的空间结构，在底物特异性、稳定性、催化效率等方面存在诸多不足，目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限。迄今为止，只有少量研究报道了能够与4-羟基-2-丁酮使用的(r)-选择性转氨酶。这主要是由于 (r)-选择性转氨酶的资源限制，以及底物不易被酶识别。因此，发现能够催化这种反应的新型生物催化剂，并通过酶工程提高酶活性仍然是一个艰巨的挑战。
3、最近，胺脱氢酶（amdhs）作为一类有前景的生物催化剂，用于合成高光学纯度手性胺。amdhs催化不对称还原胺化反应，使用廉价的氨作为氨基供体和nad(p)h作为还原剂对前手性酮进行胺化。相比于其他生物催化法，胺脱氢酶催化的酮与氨不对称还原胺化合成手性胺的方法，不仅所使用的氨基供体为廉价的无机氨，且反应副产物为水。 因此具有原子经济性高、产品光学纯度高、反应条件温和、环境友好、产品后处理简易等优势，在各类手性胺的合成中表现出良好的应用前景。然而，胺脱氢酶，作为一种氧化还原酶，大多依赖辅酶nadph或nadh进行催化反应，但辅酶会随着产物的生成而消耗，同时nad(p)h的高成本阻碍了其大规模生产。
4、专利公开号为cn117844772a的中国专利申请公开了一种胺脱氢酶突变体、工程菌及在合成(r)-3-氨基丁醇中的应用，但是该胺脱氢酶突变体、工程菌在应用于合成(r)-3-氨基丁醇的反应时，存在以下问题：（1）该反应属于单酶反应体系，需要消耗大量高成本的辅因子nad(p)h，不利于大规模生产；（2）该方法最优体系下的产物的收率仅75.4%，有待进一步提高。
5、总之，目前合成 (r)-3-氨基丁醇的化学方法存在步骤长，成本高，产量低以及反应条件较难操作等缺点。而目前酶催化合成(r)-3-氨基丁醇的方法需要用到高成本的催化剂酶、辅酶、助溶剂缓冲液等，且后续处理复杂，如需在低温条件下处理并用到较多试剂，不适合大规模生产。因此，针对 (r)-3-氨基丁醇合成方法，如何设计新的合成路线，并选择恰当的酶催化剂和合成条件，这是本领域亟需解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种胺脱氢酶及(r) -3-氨基丁醇的高效制备方法。
2、本发明提供了一种胺脱氢酶，它的氨基酸序列如seq id no. 2所示。
3、本发明还提供了一种基因，它的核苷酸序列如seq id no. 1所示。
4、本发明还提供了一种重组菌，它包含核苷酸序列如seq id no. 1所示的基因。
5、进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌。
6、本发明还提供了一种胺脱氢酶，它的氨基酸序列如seq id no. 4所示。
7、本发明还提供了一种基因，它的核苷酸序列如seq id no. 3所示。
8、本发明还提供了一种重组菌，它包含核苷酸序列如seq id no. 3所示的基因。
9、本发明还提供了一种脱氢酶组合物，它由上述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶组成，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no. 4所示。
10、进一步地，所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为1：（1-2）。
11、进一步地，所述胺脱氢酶或甲酸脱氢酶的制备方法包括以下步骤：
12、步骤（1），将包含核苷酸序列如seq id no. 1或seq id no. 3所示的基因的重组菌培养至菌体密度od600值达到0.7-1.0；
13、步骤（2），加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至浓度为0.8~1 mm，继续培养至od600值达到7-9；
14、步骤（3），离心收集菌体，加入缓冲液重悬菌体后，超声破碎菌悬液，离心，上清液即为含胺脱氢酶或甲酸脱氢酶的粗酶液。
15、本发明还提供了一种胺脱氢酶粗酶液，它的制备方法包括以下步骤：
16、步骤（1），将包含核苷酸序列如seq id no. 1所示基因的重组菌培养至菌体密度od600值达到0.7-1.0；
17、步骤（2），加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至浓度为0.8~1 mm，继续培养至od600值达到7-9；
18、步骤（3），离心收集菌体，加入缓冲液重悬，超声破碎，离心，上清液即为胺脱氢酶粗酶液。
19、本发明还提供了一种甲酸脱氢酶粗酶液，它的制备方法包括以下步骤：
20、步骤（1），将包含核苷酸序列如seq id no. 3所示基因的重组菌培养至菌体密度od600值达到0.7-1.0；
21、步骤（2），加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至浓度为0.8~1 mm，继续培养至od600值达到7-9；
22、步骤（3），离心收集菌体，加入缓冲液重悬，超声破碎，离心，上清液即为甲酸脱氢酶粗酶液。
23、进一步地，步骤（1）中，所述培养的培养基为lb液体培养基，培养的温度为20-37℃；步骤（2）中，所述加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至其浓度为0.1-1 mm；步骤（2）中，所述培养的温度为20-28 ℃；步骤（3）中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液，所述缓冲液的ph值为7.5。
24、本发明还提供了一种脱氢酶粗酶液组合物，其特征在于，它上述胺脱氢酶粗酶液和上述甲酸脱氢酶粗酶液组成。
25、进一步地，所述脱氢酶粗酶液组合物中，胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为1：（1-2）。
26、本发明还提供了一种基因组合物，它由核苷酸序列如seq id no. 1所示的基因和核苷酸序列如seq id no. 3所示的基因组成。
27、本发明还提供了一种重组菌组合物，它由重组菌1和重组菌2组成，重组菌1包含核苷酸序列如seq id no. 1所示的基因，重组菌2包含核苷酸序列如seq id no. 3所示的基因。
28、本发明还提供了一种制备(r)-3-氨基丁醇的方法，包括如下步骤：将4-羟基-2-丁酮和上述的脱氢酶组合物或上述的脱氢酶组合物粗酶液组合物加入含辅因子的缓冲溶液中反应，得到(r) -3-氨基丁醇。
29、进一步地，所述缓冲溶液为含辅因子的甲酸铵缓冲溶液，所述辅因子为nad+，所述缓冲溶液中辅因子的浓度为0.5-2 mm；所述反应的ph值为8~9，反应的温度为30~50℃，反应的时间为15~30 h；所述4-羟基-2-丁酮和胺脱氢酶的质量比为（0.5-2.0）：1，所述4-羟基-2-丁酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:20~100ml。
30、进一步地，所述缓冲溶液中辅因子的浓度为1 mm；所述反应的ph值为8.5，反应的温度为40℃，反应的时间为24 h；所述4-羟基-2-丁酮和胺脱氢酶的质量比为1.2：1，所述4-羟基-2-丁酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:75ml。
31、进一步地，所述反应结束后，还包括以下提纯步骤：加酸调节ph为2.5-3.5，用二氯甲烷萃取，收集水相，加碱调节ph为7.5-8.5，用二氯甲烷萃取，收集有机相，得到(r) -3-氨基丁醇。
32、本发明构建了具有高选择性、高活性的胺脱氢酶，该胺脱氢酶与甲酸脱氢酶结合作为催化剂构建出一个高效和可再生的循环系统，提供了一种重要的医药中间体手性(r)-3-氨基丁醇的制备方法。本发明在反应系统中加入甲酸脱氢酶，以牺牲廉价的底物回收辅因子，构建了一个高效、低成本的辅因子再生体系。
33、本发明涉及的双酶联用系统能够高选择性、高稳定性、高转化率地催化制备(r)-3-氨基丁醇。本发明制备方法获得的产物摩尔收率高达85%，ee值高达99.9%以上，收率明显高于现有技术cn117844772a方法最优体系下所得产物的收率（75.4％）。
34、本发明制备方法采用的辅因子nad+的成本明显低于现有技术采用的辅酶nadph或nadh，降低了成本。
35、此外，本发明以4-羟基-2-丁酮为原料，经过一步酶催化获得(r)-3-氨基丁醇，过程中只需要用到缓冲液，无需助溶剂和其他试剂，很大程度节约了成本。且本发明制备方法简化了下游分离精制工艺，是一种过程简洁、绿色环保、成本降低的新工艺。
36、综上所述，本发明具有工业化的潜力和良好的应用前景。
37、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
38、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
1.一种胺脱氢酶，其特征在于，它的氨基酸序列如seq id no. 2所示。
2.一种基因，其特征在于，它的核苷酸序列如seq id no. 1所示。
3.一种重组菌，它包含核苷酸序列如seq id no. 1所示的基因。
4.一种胺脱氢酶粗酶液，其特征在于，它的制备方法包括以下步骤：
5.一种脱氢酶组合物，其特征在于，它由权利要求1所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶组成，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no. 4所示。
6.根据权利要求5所述的脱氢酶组合物，其特征在于，所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量比为1：（1-2）。
7.一种脱氢酶粗酶液组合物，其特征在于，它由权利要求4所述胺脱氢酶粗酶液和甲酸脱氢酶粗酶液组成，所述甲酸脱氢酶粗酶液中，甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no. 4所示。
8.一种制备(r)-3-氨基丁醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：将4-羟基-2-丁酮和权利要求5-6任一项所述的脱氢酶组合物或权利要求7所述的脱氢酶组合物粗酶液组合物加入含辅因子的缓冲溶液中反应，得到(r) -3-氨基丁醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为含辅因子的甲酸铵缓冲溶液，所述辅因子为nad+，所述缓冲溶液中辅因子的浓度为0.5-2 mm；所述反应的ph值为8~9，反应的温度为30~50℃，反应的时间为15~30 h；所述4-羟基-2-丁酮和胺脱氢酶的质量比为（0.5-2.0）：1，所述4-羟基-2-丁酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:20~100ml。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液中辅因子的浓度为1 mm；所述反应的ph值为8.5，反应的温度为40℃，反应的时间为24 h；所述4-羟基-2-丁酮和胺脱氢酶的质量比为1.2：1，所述4-羟基-2-丁酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:75ml。
