本发明属于基因检测服务，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型三重荧光定量pcr检测方法。
背景技术：
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,prrsv)引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统传染病，主要引起妊娠母猪流产、死胎和产木乃伊胎，仔猪表现为呼吸障碍。prrs已成为全球养猪业中最严重的疾病之一。根据prrsv基因组的序列差异度，将其分为以lelystad virus(lv)为代表的欧洲基因型和以经典毒株vr-2332为代表的美洲基因型。两种毒株在形态和理化性状上相似，但在抗原性和细胞嗜性方面不同。欧洲型和美洲型毒株基因序列存在很大的差异，其中nsp2基因差异较大，对应的氨基酸同源性仅有32％左右。我国以美洲型毒株居多。
2、该病自1995年传入我国，2006年我国爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征(hp-prrs)，2013年出现的类nadc30毒株，2017年，我国首次检测到类nadc34 prrsv，并且该毒株的检出率逐年上升，有取代类nadc-30prrsv成为主要流行毒株的趋势。相比于经典猪繁殖与呼吸综合征病毒vr-2332的nsp2序列，我国高致病性毒株(hp-prrsv)在nsp2区域具有不连续的30个氨基酸缺失。而类nadc30毒株的nsp2有三个不连续的氨基酸缺失区域，总计131个氨基酸缺失。类nadc34毒株的特征则是nsp2区域存在连续的100个氨基酸缺失。
3、prrsv给我国养猪业造成了严重的经济损失。迄今为止，prrs的防控主要以疫苗为主，使用的毒株主要有经典毒株和高致病性毒株两大类，然而，目前可使用的商品化疫苗只对同源毒株的感染具有较好的保护力，对异源毒株感染所能产生的保护效果较差。这也是造成prrs反复爆发和不断有新的变异毒株出现的重要原因。正因此，近些年prrsv流行株以谱系1(类nadc30和类nadc34)最多见，高致病性毒株次之，经典毒株较少遇到。
4、在实验室检测中，qpcr检测方法备受青睐，该方法具有特异性好、灵敏度高、准确、可定量等优点。目前临床上商品化荧光定量pcr试剂盒，酶、引物、探针均需要现配现用，操作较为繁琐，误差的可能性较大，急需一种方便快捷的检测方法。
5、冻干技术，是一种在低温低压条件下利用水的升华性能进行干燥的方法。其基本原理是将含水物料冷冻成固体，然后在高真空状态下，使固态冰直接升华成水蒸气，从而去除水分，达到干燥的目的。这一过程在零度以下甚至更低温度下进行，避免了传统干燥方法中高温可能导致的物质变性、营养成分损失和微生物失活等问题。冻干技术不仅能有效保存物质的原有结构和形状，还能最大程度地保留物质的生物活性和营养成分。
6、截至目前，还没有一种同时鉴定prrsv高致病性毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的多重荧光定量pcr检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型三重荧光定量pcr检测方法，即在筛选获得了多重pcr扩增引物对和探针的基础上，建立了一种可以一次pcr就鉴别猪繁殖与呼吸综合征高致病性毒株、类nadc30毒株和类nadc34毒株的三重荧光定量pcr检测方法。
2、本发明首先提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型高致病株、美洲型类nadc30株、美洲型类nadc34株的三重荧光定量pcr检测引物对和探针组合，其中包含有：
3、1)用于检测美洲型高致病株的引物对和探针，
4、上游引物：5′-agtgggtcggcaccagtt-3′(seq id no:4)、
5、下游引物：5′-cagacaaatccagaggct-3′(seq id no:5)、
6、探针：hex-5′-cgtagaactgtgacaacaacgc-3′-bhq1(seq id no:6)；
7、2)用于检测美洲型类nadc30株的引物对和探针，
8、上游引物：5′-cggtatgtaytgagtag-3′(seq id no:7)、
9、下游引物：5′-acctaawggcgaagcaa-3′(seq id no:8)、
10、探针：fam-5′-aacgcagccagagcacagacag-3′-bhq1(seq id no:9)；
11、3)用于检测美洲型类nadc34株的引物对和探针，
12、上游引物：5′-acgacaaatgcgtggtt-3′(seq id no:10)、
13、下游引物：5′-accacgttgaaagtgtc-3′(seq id no:11)、
14、探针：rox-5′-tttgccgttatcggatgaaa-3′-bhq2(seq id no:12)。
15、更进一步的，其中检测高致病性毒株的探针5′端连接有荧光素hex，3′端连接有荧光素bhq1；
16、检测类nadc30的探针5′端连接有荧光素fam，3′端连接有荧光素bhq1；
17、检测类nadc34的探针5′端连接有荧光素rox，3′端连接有荧光素bhq2。
18、本发明再一个方面还提供一种多重荧光定量pcr检测试剂盒，其中包含有上述的引物对和探针组合。
19、本发明还提提供一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型高致病株、美洲型类nadc30株、美洲型类nadc34株的方法，所述的方法是使用上述的引物对和探针进行多重pcr荧光定量检测；
20、所述的方法，其中高致病性毒株引物上下游各0.4μmol/20μl，探针0.3μmol/20μl；类nadc30引物上下游各0.3μmol/20μl，探针0.2μmol/20μl；类nadc34引物上下游各0.4μmol/20μl，探针0.3μmol/20μl。
21、本发明通过优化设计及正交实验进行引物探针剂量筛选，确定最优剂量组合，既保证了各引物对扩增效率相近，检测灵敏度最高，又达到最低消耗原材料的目的。
1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型高致病株、美洲型类nadc30株、美洲型类nadc34株的三重荧光定量pcr检测引物对和探针组合，其特征在于，所述的引物对和探针组合中包含有：
2.如权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于，所述的检测高致病性毒株的探针的5′端连接有荧光素hex，3′端连接有荧光素bhq1。
3.如权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于，所述的检测类nadc30的探针5′端连接有荧光素fam，3′端连接有荧光素bhq1。
4.如权利要求1所述的引物对和探针组合，其特征在于，所述的检测类nadc34的探针5′端连接有荧光素rox，3′端连接有荧光素bhq2。
5.一种多重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1所述的引物对和探针组合。
6.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型高致病株、美洲型类nadc30株、美洲型类nadc34株的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的引物对和探针组合进行多重pcr荧光定量检测。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法，其中高致病性毒株引物上下游各0.4μmol/20μl，探针0.3μmol/20μl；类nadc30引物上下游各0.3μmol/20μl，探针0.2μmol/20μl；类nadc34引物上下游各0.4μmol/20μl，探针0.3μmol/20μl。
