本发明属基因工程，具体涉及一种通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树木材材性和氮素利用能力的方法。
背景技术：
1、植物经光合作用产生的蔗糖，一部分用于叶片自身的生长代谢，另一部分通过韧皮部长距离运输到库组织。蔗糖从源到库的长距离运输有两条途径：第一条为共质体途径，通过胞间连丝运输；第二条为质外体途径，通过蔗糖转运蛋白(sut)运输。
2、植物中光合同化物的运输和分配已经成为研究热点，蔗糖由源到库的运输效率与许多实际生产息息相关。杨树作为重要的经济林木，广泛应用于能源利用和造纸产业，有较高的生态和经济价值。毛果杨(populus trichocarpa torr.&gray)属杨柳科杨属植物，生长迅速，分布广泛，适应能力强。毛果杨是最早完成全基因组测序的树种，遗传背景清晰，已经成为林木分子生物学研究的模式植物。
3、氮素是植物生长发育的必需元素。对于木本植物而言，氮素利用能力影响木材材性，例如，杂交杨在高氮条件下木材密度降低；高氮也会导致毛果杨的茎节间伸长、细胞壁增厚和木质素增加。
4、此外，关于调节响应氮素的杨树蔗糖转运蛋白基因的表达水平来改变库中碳的分配、进而改变木材材性的相关研究还未见报道。因此，鉴定蔗糖转运质外体途径的sut基因与杨树木材材性和氮素利用能力的关系，将有利于培育杨树优良种质。
技术实现思路
1、针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树木材材性和氮素利用能力的方法。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树木材材性和氮素利用能力的方法，所述方法是在毛果杨中过量表达蔗糖转运蛋白基因ptrsut3，获得高纤维素含量和高氮素利用能力的转基因毛果杨；所述蔗糖转运蛋白基因ptrsut3的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本发明还提供了上述转基因毛果杨的构建方法，包括步骤如下：
5、(1)以毛果杨无菌苗cdna为模板，设计如下克隆ptrsut3基因的特异性引物。引物序列如下：
6、ptrsut3-f：atggagagtggagttagaaaagaag
7、ptrsut3-r：tcaatggaatgcagcagtgacagcc
8、使用kod酶在50μl体系中进行pcr反应。pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min 15sec，35个循环，72℃延伸7min，16℃保存。
9、将扩增产物克隆到zero topo-blunt载体中，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；挑取单克隆pcr验证并测序，即获取长度为1608bp毛果杨ptrsut3基因的全长cdna序列。
10、所述蔗糖转运蛋白基因ptrsut3的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
11、(2)根据ptrsut3基因的cds序列设计基因特异性引物，并在上下游引物两端加上xbai和kpni酶切位点及相应的保护碱基，终止密码子前加入flag标签的编码序列。引物序列如下：
12、ptrsut3-xbai-f：gctctagaatggagagtggagttagaaaagaagacaaaccc
13、ptrsut3-kpni-r：ggggtacctcacttgtcatcgtcgtccttgtagtcatggaatgcagca
14、以zero topo-blunt-ptrsut3质粒为模板，利用ptrsut3-xbai-f和ptrsut3-kpni-r引物进行pcr扩增，扩增的反应程序如步骤(1)。
15、利用酶切和连接技术将上述pcr扩增产物与改良的prokⅱ载体(含有dx15启动子)进行整合。
16、双酶切反应体系如下：
17、使用xbai和kpni酶在50μl体系中进行双酶切反应，反应体系为：10×quickcutbuffer，5μl；dna，1μg；quickcut enzyme，1μl；加ddh2o至50μl。37℃反应10-15min。
18、连接体系如下：
19、使用t4 dna ligase在20μl体系中进行连接反应，反应体系为：10×t4 dnaligase buffer，2μl；载体dna，50ng；插入的外源dna片段(与载体dna的摩尔比约为3:1)；t4dna ligase(350u/μl)，1μl；16℃过夜连接。
20、(3)连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取单克隆pcr验证并测序，即获得ptrsut3重组载体。
21、热激转化步骤如下：
22、将5μl连接产物加到30μl感受态细胞中，混匀后冰浴30min；42℃热激45sec，冰浴2min；加入250μl液体lb培养基，37℃、180r/min振荡培养60min；将复苏的菌液全部用于涂板(含有50mg/l氨苄青霉素的lb固体培养基)；37℃培养箱中过夜培养。
23、lb培养基配方如下：
24、lb液体培养基：胰蛋白胨，10g/l；酵母提取物，5g/l；nacl，10g/l；lb固体培养基：在上述试剂中入15g/l的琼脂粉。121℃高压灭菌。
25、(4)将重组载体转化农杆菌gv3101感受态细胞，验证后获得农杆菌工程菌株。
26、电转化农杆菌感受态细胞操作步骤如下：
27、用无水乙醇清洗电转杯，将50ng质粒加到50μl农杆菌感受态细胞中；混合后全部转移到电转杯中；电压1.8kv电击3.5-5msec；加入200μl lb液体培养基，将混合液全部转移到离心管中，28℃、180r/min振荡培养4h；利用100μl菌液涂板(含有卡那霉素和利福平的lb固体培养基)，28℃避光培养48h；从平板上挑取农杆菌单克隆进行pcr验证，并进行测序，保存测序正确的农杆菌，用于后续遗传转化试验。
28、(5)农杆菌侵染毛果杨茎段，经共培养、筛选培养、分化培养后获得毛果杨转基因植株。
29、侵染按照如下方法进行：
30、a.农杆菌的活化
31、从三级划线的平板上挑取农杆菌单菌落置于20ml yep培养基中，28℃、180r/min振荡培养16-18h，od600为0.8～1.0；再按1％的比例将菌液重新扩大培养至od600为0.6，5000r/min离心10min，用侵染液重悬菌体至od600为0.6。
32、b.毛果杨组培苗的准备：将毛果杨顶芽插入生根培养基中培养21-28d(25℃，16h光照/8h黑暗)。
33、c.侵染及共培养：将长度约1cm的毛果杨茎段外植体放入侵染液中20min。用镊子取出毛果杨茎段外植体置于无菌滤纸上吸干侵染液；将茎段外植体转移到共培养培养基中，避光培养2-3d。
34、d.筛选分化及生根
35、将暗培养2-3d后的茎段外植体转移到筛选分化培养基中，每隔15d更换一次培养基。抗性芽长出后转移到筛选生根培养基中生根。
36、yep培养基配制方法如下：
37、胰蛋白胨，16g/l；酵母提取物，8g/l；nacl，5g/l；121℃高压灭菌20min。
38、生根培养基配制方法如下：
39、wpm培养基，2.41g/l；蔗糖，25g/l；iba，0.1mg/l；琼脂，0.55％；121℃高压灭菌20min。
40、共培养培养基配制方法如下：
41、wpm培养基，2.41g/l；蔗糖，25g/l；iba，0.02mg/l；6ba，0.03mg/l；tdz，0.0008mg/l；as，80μmol/l；琼脂，0.55％；121℃高压灭菌20min。
42、筛选分化培养基配制方法如下：
43、wpm培养基，2.41g/l；蔗糖，25g/l；iba，0.02mg/l；6ba，0.03mg/l；tdz，0.0008mg/l；卡那霉素，30mg/l；头孢霉素，200mg/l；琼脂，0.55％；121℃高压灭菌20min。
44、筛选生根培养基配制方法如下：
45、wpm培养基，2.41g/l；蔗糖，5g/l；iba，0.1mg/l；卡那霉素，30mg/l；头孢霉素，200mg/l；琼脂，0.55％；121℃高压灭菌20min。
46、本发明还提供了一种能提高杨树纤维素含量和氮素利用能力的农杆菌转化载体dx15::ptrsut3-prokⅱ。
47、本发明还公开了一种通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树木材材性和氮素利用能力的方法及获得的杨树转基因品系。
48、本发明未详细说明的均可以按照现有技术进行。
49、本发明的有益效果在于：
50、1.本发明在毛果杨中过量表达蔗糖转运蛋白基因ptrsut3，有效地为纤维素的生物合成提供了前体物质；与野生型毛果杨相比，过量表达蔗糖转运蛋白基因ptrsut3的毛果杨植株纤维素含量显著提高(纤维素含量提高了41.1～69.2％)。
51、2.本发明提供了通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树纤维素含量的技术和方法，同时公开了过量表达蔗糖转运蛋白基因ptrsut3所获得的杨树转基因品系，为进一步筛选杨树优良品种奠定了基础，也有利于利用该转基因杨树大量生产优良木材。
52、3.通过本发明方法得到的转基因杨树表现出明显的高氮素利用能力，证实本发明方法是一种高效、可持续的解决杨树在氮素缺乏地区生存问题的有效途径，具有广阔的应用前景。
1.一种通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树木材材性和氮素利用能力的方法，其特征在于所述方法是在毛果杨中过量表达蔗糖转运蛋白基因ptrsut3，获得高纤维素含量和高氮素利用能力的转基因毛果杨；所述蔗糖转运蛋白基因ptrsut3的核苷酸序列如seqid no.1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，高纤维素含量和高氮素利用能力。
3.权利要求1所述的高纤维素含量和高氮素利用能力的转基因毛果杨的构建方法，其特征在于，包括步骤如下：
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述质粒载体dx15::ptrsut3-prokⅱ的构建方法具体如下：
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述土壤培养按照如下方法进行：
6.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述nh4no3处理按照如下方法进行：
7.一种能提高毛果杨纤维素含量和氮素利用能力的农杆菌转化载体dx15::ptrsut3-prokⅱ。
8.一种利用权利要求1所述通过过量表达蔗糖转运蛋白基因提高杨树木材材性和氮素利用能力的方法获得的毛果杨转基因品系。
