白蛋白二氧化锰复合纳米粒子的制备方法及抑制β淀粉样蛋白聚集和清除活性氧的应用

白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的制备方法及抑制
β
淀粉样蛋白聚集和清除活性氧的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及抑制淀粉样蛋白聚集和清除活性氧的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子和制备方法及其应用。特别是白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的制备方法及抑制β淀粉样蛋白聚集和清除活性氧的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是一种神经退行性疾病，可导致进行性记忆减退、认知障碍、性格改变等(progress in neurobiology,2002,66:191-203,nature,2004,430:631-639,lancet,2016,388:505-517)。随着人口的老龄化程度进一步加深，随之而来发病率、患病率及死亡率也均显著增高，给社会带来沉重压力。目前，在全世界范围内约有5000万人患有ad，预计在2050年时该数字将会达到1.5亿人(the lancet,2021,397:1577-1590)。
3.虽然ad的致病机理尚未研究清楚，有部分学者提出tau蛋白过度磷酸化学说、神经炎性学说、氧化应激学说和能量代谢学说等，但目前较为公认的为β-淀粉样蛋白(amyloid beta，aβ)级联假说(aβcascade hypothesis)。aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursuor protein，app)被β分泌酶和γ分泌酶剪切分泌而成。ad致病原因在于aβ在患者脑内聚集沉积，形成aβ寡聚体和纤维，并对神经元细胞产生毒性和细胞内的氧化压力，甚至会逐渐导致神经元突触功能障碍的发生(science,2002,297:353-356,embo molecular medicine,2016,8:595-608)，从而导致神经元的死亡，最终导致患者的神经系统受到损伤。主要的临床表现为：记忆障碍、失语、失认、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆。因此设计合成aβ抑制剂，利用抑制剂与aβ之间的相互作用，使aβ形成低毒的无定型聚集体，可能是解决aβ寡聚体和纤维对神经系统损伤，有望成为治疗ad的策略之一。
4.在生物的代谢系统中，内源ros由内源性过程(如o2代谢和细胞信号传递)产生，而外源性ros则由环境应激(如电离辐射和热暴露)产生(eur j med chem,2021,209:112891)。与生物有关的ros包括超氧阴离子自由基(o2·-)、羟基自由基(
·
oh)、过氧化氢(h2o2)、氢过氧自由基(
·
o2h)、单线态氧(1o2)、过氧化物(o
22-)和氢氧离子(oh-)(nano research,2018,11:4955-4984)。在细胞膜、线粒体和内质网中发现的一种膜结合酶——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nadph氧化酶)，负责细胞内ros的大量产生，nadph氧化酶通过将细胞内nadph的电子跨膜，转移产生超氧阴离子自由基(o2·-)(neurochemical research,2021,46:77-87)。ros是多种细胞功能所必需的，包括受体介导的信号通路和转录激活等；此外，ros还通过调节细胞凋亡在细胞稳态中起着关键作用(nano research,2018,11:4955-4984,chem rev,2019,119:1221-1322)。在正常情况下，ros由先天性抗氧化防御系统调节。然而病理条件下，会引起ros产生和清除之间的不平衡，最终导致ros水平失调，氧化应激，氧化脂质、蛋白质和细胞损伤。在神经退行性疾病中，以ad为例，aβ的产生和积累可作为一种晚期糖基化终产物(age)与晚期糖基化终产物受体(rage)相互作用，激活
下游途径产生ros(acta pharmacologica sinica,2017,38:1205-1235,journal of neuroinflammation,2018,15,frontiers in aging neuroscience,2020,12:227)；同时金属离子稳态失衡，(fe(ii)或cu(ii)等过渡金属离子通过类芬顿反应产生的ros，使线粒体功能紊乱导致氧化压力(chem rev,2019,119:1221-1322,drug discovery today,2021,26:794-803)。
5.二氧化锰(mno2)是一种成熟的纳米酶，具有多酶活性和有趣的物理化学特性。研究发现，由于mno2具有内在的超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)类似活性(angew chem int ed engl,2016,55:6646-6650,angew chem int ed engl,2017,56:13661-13665,journal of materials chemistry b,2020,8:1191-1201,applied surface science,2020,534)，因此可以在体外和体内有效地清除细胞内有害的活性氧(ros)。此外，人血清白蛋白(hsa)是一种丰富的血清蛋白，由于其具有生物相容性好的优势，已被证明是负载化疗药物、降糖药物、光敏剂和放射性同位素的理想药物载体，且在之前的研究中发现，hsa本身即是一种天然的aβ聚集抑制剂(biophysical journal,2009,97:2585-2594,journal of the american chemical society,2017,139:15437-15445)。
6.本发明基于人血清白蛋白hsa进行设计，引入具有sod和cat类似活性的二氧化锰，得到了具有多功能的，能够有效地抑制aβ聚集，清除aβ诱导产生有害的活性氧和降低促炎症细胞因子的水平。在治疗和预防阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药物研发中有良好的应用前景。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种多功能的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子(hmn nps)及其制备方法和应用。本发明所得的hmn nps不仅对β淀粉样蛋白聚集有显著的抑制效果，还能够清除或降低由aβ诱导产生的ros和促炎症细胞因子，能够用于阿尔茨海默病等神经退行性疾病的预防和治疗。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供一下技术方案：
9.白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的制备方法；其特征是，包括以下步骤：
10.(1)将氯化锰溶于去离子水中，得到预溶液；
11.(2)将预溶液加入含有白蛋白的去离子水溶液中混合，进行预先搅拌孵育；
12.(3)将步骤(2)得到的氯化锰和白蛋白的混合溶液，加入碱液进行调节ph，敞口搅拌孵育反应，得到白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子hmn nps。
13.所述的步骤(3)中的混合溶液ph调节为7.5-8.5，优选为8.0。
14.所述的步骤(2)二氯化锰和白蛋白溶液的质量比为(1-3):(8-12)，优选为2.52:10。
15.所述的步骤(2)中，二氯化锰和白蛋白混合预先孵育15-25min，优选为20min。
16.所述的步骤(2)和步骤(3)搅拌过程中转速为950-1100rpm，优选为1000rpm。
17.所述的步骤(3)中敞口孵育时间为120min。
18.所述的步骤(3)得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的粒径为18.5-23.5nm，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子中二氧化锰的质量含量为10.21-10.39％。
19.本发明制备的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子具有抑制aβ聚集，清除活性氧和降
低促炎症细胞因子的hmn nps在治疗或预防神经退行性疾病药物中的应用。
20.本发明制备的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子具有在制备、治疗或预防神经退行性疾病或蛋白质聚集相关疾病药物中的应用。
21.本发明制备的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子具有在治疗或预防抑制阿尔茨海默病疾病药物中的应用。
22.具体说明如下：
23.在上述技术方案中，所述制备方法，将含有二氯化锰的预溶液与白蛋白溶液混合之后，采用磁力搅拌辅助二氯化锰和白蛋白混合均匀，预先孵育，并将反应体系调为碱性，敞口搅拌，以及通过透析纯化得到白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子。
24.进一步地，在上述技术方案中，所述的预先孵育结束的混合溶液ph调节为7.5-8.5，优选为8.0。
25.进一步地，在上述技术方案中，所述二氯化锰和白蛋白溶液的质量比为(1-3):(8-12)，优选为2.52:10。
26.优选地，在上述技术方案中，将二氯化锰和白蛋白混合预先孵育15-25min，优选为20min。
27.优选地，在上述技术方案中，搅拌过程中转速为950-1100rpm，优选为1000rpm。
28.具体地，所述的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的粒径为18.5-23.5nm，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子中二氧化锰的质量含量为10.21-10.39％。
29.本发明提供了一种白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
30.如所述的步骤(1)，将mncl2溶于0.5-1.5ml去离子水中，配制得到15.9-20mm的氯化锰预溶液；如所述的步骤(2)，将氯化锰预溶液缓慢加入1.5-3ml含有8-12mg hsa的水溶液中，搅拌培养15-25min；如所述的步骤(3)，将naoh(1m)加入反应溶液中，调节ph至7.5-8.5。最后在室温条件下敞口，950-1100rpm搅拌反应120min。反应混合液转移至透析袋(mwco，10-14kda)中用蒸馏水透析2d，冻干获得hmn nps，-20℃冷藏备用。
31.优选地，将1ml 20mm mncl2预溶液缓慢加入2ml含有10mg hsa的水溶液中，搅拌培养20min。然后将naoh(1m)加入反应溶液中，调节ph至8.0。最后在室温条件下敞口，1000rpm搅拌反应120min。反应混合液转移至透析袋(mwco，10-14kda)中用蒸馏水透析2d，冻干获得hmn nps，-20℃冷藏备用。
32.本发明提供了上述白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子，具有抑制aβ聚集，清除活性氧和降低促炎症细胞因子的hmn nps在治疗或预防神经退行性疾病药物中的应用。
33.本发明的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子抑制β淀粉样蛋白聚集和清除活性氧的应用；具体地，所述疾病为阿尔茨海默病。aβ的错误折叠和聚集是导致阿尔茨海默病致病原因之一。将金属氧化物纳米粒子与白蛋白相互结合，即提高了金属氧化物纳米粒子的生物相容性和稳定性，又增强了白蛋白抑制淀粉样蛋白聚集的能力。此外，从抑制淀粉样蛋白aβ聚集和清除活性氧两方面的解决方案使hmn nps在阿尔茨海默病的治疗与预防中具有良好和广阔的应用前景。
34.在本发明中，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够抑制淀粉样蛋白aβ的聚集，同时能够缓解在淀粉样蛋白aβ聚集过程中所诱导产生的细胞毒性。因为淀粉样蛋白在患者脑内会自发的聚集，由单体先聚集为，毒性更高的寡聚体，再而形成原纤维，最终形成成熟纤维。
hmn nps能够有效的阻止这一过程的发生。利用tht荧光探针法和原子力显微轻敲模式实验下，可知当抑制剂浓度为100μg/ml时，hmn nps能抑制90.2％的aβ
40
纤维，并且能够显著减少aβ
40
纤维的量，纤维长度也明显变短。表明hmn nps能够显著地抑制aβ
40
纤维的生成。此外利用mtt实验，可知当sh-sy5y细胞与aβ
40
聚集体共培养72h后，细胞活性下降至68.9％。当hmn nps的浓度为25μg/ml时，其能够显著降低aβ
40
聚集体的细胞毒性，并将细胞活性提升至85.1％，进一步将hmn nps的浓度提升为100μg/ml时，几乎完全抑制了aβ
40
的毒性，使细胞活性提升至94％。综上结果说明，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够有效的缓解aβ
40
诱导产生的细胞毒性。
35.同时，β淀粉样蛋白会通过小胶质细胞的细胞膜上的晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation endproducts,rages)进入细胞，从而提高了促炎症细胞因子的分泌。此外，促炎症细胞因子与aβ共同作用于神经细胞，诱导ros的产生，从而损伤神经细胞。hmn nps能够有效的降低由aβ诱导产生的促炎症细胞因子。利用二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)法检测细胞内的ros的水平。hmn nps能显著减少绿色荧光，说明hmn nps能有效抑制或清除由aβ
40
诱导产生的ros，缓解ros对细胞的氧化损伤。采用双抗体夹心elisa法(sandwich elisa)检测样品中促炎症细胞因子。hmn nps降低aβ
40
诱导bv-2产生的促炎症细胞因子。与对照组相比，aβ
40
处理后的细胞tnf-α和il-6水平明显升高，分别升高了92.8％和103.3％。hmn nps能够有效降低促炎症因子tnf-α和il-6水平，分别降低至aβ
40
处理组的57.6％和54.5％。综上结果说明，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够有效的降低aβ
40
诱导产生的促炎症细胞因子。
36.本发明的优点：
37.(1)白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子在100μg/ml浓度条件下，能够有效抑制aβ
40
的聚集，阻止90.2％淀粉样蛋白纤维的生产。
38.(2)100μg/ml白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够抑制由aβ聚集所诱导产生的神经细胞毒性，缓解了aβ聚集过程的毒性，使细胞活性恢复至94.1％。
39.(3)白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够有效清除由aβ诱导产生的活性氧，并且能够有效降低促炎症因子tnf-α和il-6水平，分别降低至aβ
40
处理组的57.6％和54.5％。
附图说明
40.图1为本发明中制备白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的合成示意图。
41.图2为本发明实施例3制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的透射电子显微图。
42.图3为本发明实施例3制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的紫外可见吸收光谱(a)、x-射线光电子能谱(b)和mn2p的x-射线光电子能谱(c)。
43.图4为本发明实施例4中不同浓度白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子和hsa与aβ
40
共同培养72h后的tht荧光。
44.图5为本发明实施例5中100μg/ml hmn nps和hsa与aβ
40
共同培养72h后的形貌图。
45.图6为本发明实施例6中hmn nps和hsa缓解aβ
40
诱导sh-sy5y细胞毒性。
46.图7为本发明实施例7中hmn nps和hsa清除aβ
40
诱导sh-sy5y产生的活性氧。
47.图8为本发明实施例8中hmn nps和hsa降低aβ
40
诱导bv-2产生的促炎症细胞因子。
具体实施方式
48.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
49.本发明提供了一种白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的制备方法及抑制β淀粉样蛋白聚集和清除活性氧的应用。多种实验手段证明，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子可以显著抑制aβ
40
的聚集。此外，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子具有良好的抗氧化性能，能够有效减少胞内活性氧，同时降低促炎症细胞因子的水平。通过透射电子显微镜、紫外可见吸收光谱和x-射线光电子能谱表征白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的基本性质；白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子抑制aβ
40
聚集的能力是通过tht荧光和原子力显微镜等方法测定，缓解由aβ
40
诱导产生的细胞毒性是通过mtt比色法测定，其清除胞内的活性氧和降低促炎症细胞因子是通过荧光显微镜实验和酶联免疫吸附测定。
50.白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的制备
51.实施例1：(1)将mncl2溶于0.5ml去离子水中，配制得到15.9mm的氯化锰预溶液；(2)将氯化锰预溶液加入1.5ml含有8mg hsa的水溶液中，950rpm搅拌培养15min；(3)将naoh(1m)加入反应溶液中，调节ph至7.5；最后在室温条件下敞口，950rpm搅拌反应120min。反应混合液转移至透析袋(mwco，10-14kda)中用蒸馏水透析2d，冻干获得hmn nps，-20℃冷藏备用。
52.实施例2：(1)将mncl2溶于1.5ml去离子水中，配制得到15.9mm的氯化锰预溶液；(2)将氯化锰预溶液加入3ml含有12mg hsa的水溶液中，1100rpm搅拌培养25min；(3)将naoh(1m)加入反应溶液中，调节ph至8.5；最后在室温条件下敞口，1100rpm搅拌反应120min。反应混合液转移至透析袋(mwco，10-14kda)中用蒸馏水透析2d，冻干获得hmn nps，-20℃冷藏备用。
53.实施例3：(1)将mncl2溶于1ml去离子水中，配制得到20mm的氯化锰预溶液；(2)将氯化锰预溶液加入2ml含有10mg hsa的水溶液中，1000rpm搅拌培养20min；(3)将naoh(1m)加入反应溶液中，调节ph至8.0；最后在室温条件下敞口，1000rpm搅拌反应120min。反应混合液转移至透析袋(mwco，10-14kda)中用蒸馏水透析2d，冻干获得hmn nps，-20℃冷藏备用。
54.图1为本发明中制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的合成示意图。下文中所提到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子均以优选条件下的实施例3作为研究对象。
55.图2为本发明实施例3制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的tem图。从图2中的结果可以看出，制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子粒径分布单一，分散性良好，粒径约为21
±
0.51nm。复合粒子内部有致密的二氧化锰颗粒。
56.此外，按照如下方法检测所得白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的紫外-可见吸收光谱：分别将1ml的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子溶液和人血清白蛋白溶液盛于标准比色皿中，使用紫外分光光度计测试样品在200-800nm范围内的吸收率，得到样品的紫外-可见吸收光谱。
57.图3a为本发明实施例3制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的紫外-可见吸收光谱结果。白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子不仅在280nm处有蛋白质的特征吸收峰，而且在300-400nm处有较宽的mno2的吸收峰，而人血清白蛋白仅在280nm处有特征的吸收峰。
58.图3b和3c为本发明实施例3制备得到的白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的x-射线
光电子能谱的结果。由结果可知白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的x-射线光电子能谱可知，hmn nps中包含c、o、n和mn元素；且更高分辨率的mn2p能谱中有两个特征峰，分别为653.3ev和641.6ev，双峰间距为11.7ev；所以此双峰分别是mno2中自旋-轨道分裂峰mn(iv)2p
1/3
和mn(iv)2p
2/3
，由此可知，hmn nps中含有mno2。综上结果说明，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子成功制备。
59.实施例4：hmn nps和hsa与aβ
40
共同培养时的tht荧光的影响
60.首先将aβ
40
粉末静置于室温下20min，配制1.0mg/ml hfip的aβ
40
溶液。将溶液静置于4℃2h，冰浴超声30min，以破坏已经存在的aβ
40
纤维。将溶液置于-80℃12h，使用冷冻干燥仪去除hfip，将处理好的aβ
40
单体粉末保存于-20℃。在使用aβ
40
之前，用20mm naoh将aβ
40
单体配制为275μm的溶液，冰浴超声10min，以确保aβ
40
完全溶解。然后再4℃16000g的离心条件下，将aβ
40
溶液离心20min。小心收集75％的上清液作为aβ原液以供后续使用。
61.称取hmn nps或hsa分别溶于含27.5μm tht的pbs缓冲液(100mm,，ph 7.4，含20mm nacl)中，获得抑制剂溶液。取275μm的aβ
40
母液，分别用ga和egcg溶液稀释，获得终浓度为25μm的aβ
40
溶液，在37℃，150rpm的空气浴摇床条件下避光孵育72h。取200μl滴入96孔板，每组做三次平行，通过酶标仪测定tht荧光，激发波长为440nm，发射波长为480nm，激发光和发射光带宽均为5nm。
62.图4为本发明实施例4中不同浓度白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子和hsa与aβ
40
共同培养72h后的tht荧光。随着hmn nps和hsa浓度的提高，二者对aβ
40
聚集的抑制作用也随之增强，呈现浓度依赖性；即hmn nps和hsa均有一定的抑制能力。当抑制剂浓度为100μg/ml时，hmn nps和hsa分别能抑制90.2％和49.1％的aβ
40
纤维。上述结果表明，hmn nps的抑制效果要优于hsa。
63.实施例5：hmn nps和hsa对aβ
40
聚集生长形态的影响
64.如实施例4方法配置aβ
40
母液，用pbs缓冲液(100mm,，ph 7.4，含20mm nacl)稀释，得到终浓度为25μm的aβ
42
溶液。再配制含有100μg/ml hmn nps或hsa的aβ
40
溶液，溶液中aβ
40
的终浓度为25μm。将上述溶液于37℃，150rpm条件下进行培养。培养72h后，取50μl滴在云母片上，静置5min，使样品与云母表面充分结合。随后用去离子水缓慢洗涤7次，去除缓冲液中的盐离子，最后使用匀胶机(kw-a4，imecas，中国)在1000rpm条件下干燥60s。使用原子力显微镜(cspm5500，本原，中国)中的轻敲模式下观察aβ
40
聚集体的形貌。
65.图5为本发明实施例5中100μg/ml白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子和hsa与aβ
40
共同培养72h后的形貌图。从图5a可以看出，aβ
40
单独培养72h后形成密集的纤维状聚集体，图5b中hsa与aβ
40
共同培养时，aβ
40
纤维的数量有明显的减少。而图5c中，与hsa相比hmn nps能够显著减少aβ
40
纤维，纤维长度也明显变短。表明hmn nps能够显著地抑制aβ
40
纤维的生长，有效降低生成aβ
40
纤维的数量。
66.实施例6：hmn nps和has缓解aβ
40
诱导sh-sy5y产生细胞毒性的影响
67.使用含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem/f12培养基作为人神经母细胞瘤细胞(sh-sy5y)细胞株的培养基。在含有5％co2的细胞培养箱中恒温(37℃)培养。取灭菌的96孔板，每孔加入80μl细胞(8
×
103个)，培养24h，使细胞贴壁。随后加入20μl待测样品(25μm aβ
40
与不同浓度的抑制剂)，继续培养48h。用灭菌的hepes缓冲液(含有20mm hepes和100mm nacl，ph＝7.4)配制5.5mg/ml的mtt溶液。每孔加10μl mtt溶液，继续培养
4h。随后将细胞培养板在1500rpm下离心10min，弃去上清液。每孔加入100μl二甲基亚砜，将孔板放于37℃、150rpm的空气摇床中孵育15min，直至孔板中蓝紫色甲臜完全溶解。最后使用酶标仪检测各个样品在570nm处的吸光值。将加入pbs缓冲液的细胞组作为对照组，仅含有培养基而不含细胞的样品作为空白组。利用以下公式计算细胞活性：
[0068][0069]
图6为本发明实施例6中hmn nps和hsa缓解aβ
40
诱导sh-sy5y细胞毒性。从图6所示，当sh-sy5y细胞与aβ
40
聚集体共培养72h后，细胞活性下降至68.9％。当hmn nps的浓度为25μg/ml时，其能够显著降低aβ
40
聚集体的细胞毒性，并将细胞活性提升至85.1％，进一步将hmn nps的浓度提升为100μg/ml时，几乎完全抑制了aβ
40
的毒性，使细胞活性提升至94.1％。然而，hsa对aβ
40
诱导产生的细胞毒性只有小幅的提升。在10-100μg/ml范围内，其能将细胞活性从68.9％提升至74.9％。综上结果说明，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够有效的缓解aβ
40
诱导产生的细胞毒性。
[0070]
实施例7：hmn nps和hsa清除aβ
40
诱导sh-sy5y产生的活性氧
[0071]
如实施例6方法培养sh-sy5y细胞。利用二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)法检测细胞内的ros的水平。首先，将sh-sy5y细胞点入6孔板中，每孔加入2ml细胞(2
×
105个)，在37℃和5％co2的培养箱内培养24h。每孔分别加入500μl样品(25μm aβ
40
与100μg/ml hmn nps/hsa)，继续培养48h。去除上层培养基，然后用pbs清洗3-5次，加入2ml含有10μm dcfh-da的无血清培养基，在37℃避光的细胞培养箱内孵育20分钟。再用pbs清洗3-5次，所得样品置于荧光显微镜下观察细胞荧光图像。
[0072]
图7为本发明实施例7中hmn nps和hsa清除aβ
40
诱导sh-sy5y产生的活性氧。如图7所示，加入aβ
40
后，细胞内呈现明显绿色荧光，说明细胞内产生了大量的ros。hsa的加入能一定程度减少绿色荧光强度，但仍可观察到明显的绿色荧光，而hmn nps的加入，则能显著减少绿色荧光，说明hmn nps能有效抑制或清除由aβ
40
诱导产生的ros，缓解ros对细胞的氧化损伤。
[0073]
实施例8：hmn nps和hsa降低aβ
40
诱导bv-2产生的促炎症细胞因子
[0074]
使用含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基作为小鼠小胶质细胞(bv-2)细胞株的培养基。在含有5％co2的细胞培养箱中恒温(37℃)培养。取灭菌的6孔板，每孔加入2ml细胞(2
×
105个)，培养24h，使细胞贴壁。去除上层培养基，然后用pbs清洗3-5次，将培养基改为2.5ml无血清的dmem，其中包含10μm aβ
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和40μg/ml抑制剂刺激细胞48小时。1500rpm离心5min收集上清液，检测tnf-α(小鼠tnf-αelisa试剂盒)和il-6(小鼠il-6elisa试剂盒)的水平。
[0075]
本实验采用双抗体夹心elisa法(sandwich elisa)检测样品中靶蛋白的浓度。靶蛋白特异的单克隆捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标准品或样品时，其中的靶蛋白会与捕获抗体结合。当加入生物素化的抗靶蛋白抗体后，生物素化抗靶蛋白抗体与靶蛋白结合，形成夹心的免疫复合物。随后加入辣根过氧化物酶标记streptavidin(hrp-streptavidin)，由于生物素与链霉亲和素(streptavidin)可以特异性地结合，因此链霉亲和素连接的hrp就会与夹心的免疫复合物连接起来而被固相捕获。最后加入显色剂tmb溶液，固相捕获的辣根过氧化物酶就会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后
呈黄色。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。靶蛋白浓度与a450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中靶蛋白浓度。
[0076]
图8为本发明实施例8中hmn nps和hsa降低aβ
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诱导bv-2产生的促炎症细胞因子。与对照组相比，aβ
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处理后的细胞tnf-α和il-6水平明显升高，分别升高了92.8％和103.3％。在抑制剂存在的情况下，这两种细胞因子均有降低，与hsa相比，hmn nps能够有效降低促炎症因子tnf-α和il-6水平，分别降低至aβ
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处理组的57.6％和54.5％。综上结果说明，白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子能够有效的降低aβ
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诱导产生的促炎症细胞因子。
[0077]
本发明提出了白蛋白/二氧化锰复合纳米粒子的设计，提出了蛋白质模板法在制备抑制β-淀粉样蛋白聚集的药物等方面的用途，并将其应用于aβ
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的聚集、细胞毒性抑制实验和清除活性氧和降低促炎症细胞因子等方面。已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。