本发明涉及生物，具体涉及tarlk-1b蛋白及其编码基因在调控小麦抗叶锈病中的应用。
背景技术：
1、小麦叶锈病由活体病原真菌puccinia triticina(pt)引起的，是小麦三大叶部病害之一，也是分布最广，发生最普遍的一种病害，不仅会影响小麦的品质，还会造成严重的产量和经济损失(prasad p,savadi s,bhardwaj sc,gupta pk.the progress of leafrust research in wheat.fungal biol.2020,124(6):537-550.)。叶锈病主要发生在小麦生长后期的叶片、茎秆和穗部，影响植株光合作用和后期籽粒灌浆，导致每年约有2500万吨的产量损失(savary s,willocquet l,pethybridge s j,esker p,mcroberts n,nelsona.the global burden of pathogens and pests on major food crops.nat ecolevol.2019,3(3):430-439.)。迄今为止，在小麦及其野生亲缘种中已正式鉴定了80多个抗叶锈病基因，其中仅有11个抗叶锈病基因被成功克隆(ren x,wang c,ren z,wang j,zhangp,zhao s,li m,yuan m,yu x,li z,chen s,wang x,genetics of resistance to leafrust in wheat:an overview in agenome-wide level,sustainability.2023,15:3247.)。已克隆的小麦抗叶锈病基因数目仍有限，并且单一的抗病基因可能携带不良的农艺性状，容易受到不断进化变异的叶锈菌小种的克服，从而失去利用价值(dracatos pm,luj,sánchez-martín j,wulff bbh.resistance that stacks up:engineering rust andmildew disease control in the cereal crops wheat and barley.plant biotechnolj.2023,21(10):1938-1951.)。喷施农药是生产上最直接的防控手段，但其过度使用会带来严重的环境污染和食品安全风险。因此，合理部署抗病基因和培育抗病品种是控制叶锈病最经济、安全、有效和环境友好型的途径。
2、测序成本的显著降低产生了大规模高密度的dna标记，从而增强了对微效数量性状位点(qtls)的检测(yao l,li y,ma c,tong l,du f,xu m.combined genome-wideassociation study and transcriptome analysis reveal candidate genes forresistance to fusarium ear rot in maize.j integr plant biol.2020,62(10):1535-1551.)。基于全基因组重测序的全基因组关联分析(gwas)已成为小麦抗病研究中的基石。例如，利用90k illumina iselect snp芯片对268个小麦品系进行基因分型，通过gwas鉴定了22个苗期抗叶锈病qtl和22个成株期抗叶锈病qtl，这些qtl分别解释了4.6％-25.2％和4.2％-11.5％的表型变异，包括18个新的苗期抗病位点和3个新的成株期抗病位点(zhangp,yan x,gebrewahid tw,zhou y,yang e,xia x,he z,li z,liu d.genome-wideassociation mapping of leaf rust and stripe rust resistance in wheataccessions using the 90k snp array.theor appl genet.2021,134(4):1233-1251.)。富含亮氨酸重复的类受体激酶(lrr-rlk)，在启动植物防御反应中发挥关键作用，如病原体相关分子模式(pamp)触发免疫(pti)或效应子触发免疫(eti)中对抗病原菌。tarlk1和tarlk2是小麦中最早被鉴定的lrr-rlk，均正调控对小麦白粉病的抗性(chen t,xiao j,xuj,wan w,qin b,cao a,chen w,xing l,du c,gao x,zhang s,zhang r,shen w,wang h,wang x.two members of tarlk family confer powdery mildew resistance in commonwheat.bmc plant biol.2016,16:27.)。总之，不断挖掘新的抗叶锈病基因和位点，阐明其抗病机制，对于分子标记辅助选择抗病育种和培育新的抗叶锈病小麦品种具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供tarlk-1b蛋白及其编码基因在调控小麦抗叶锈病中的应用。
2、第一方面，本发明要求保护tarlk-1b蛋白或其编码基因在调控小麦对叶锈病的抗性中的应用。
3、在所述应用中，小麦中tarlk-1b蛋白的表达量降低，小麦对叶锈病的抗性减弱；小麦中tarlk-1b蛋白的表达量提高，小麦对叶锈病的抗性增强。
4、第二方面，本发明要求保护tarlk-1b蛋白或其编码基因在调控小麦对叶锈菌(puccinia triticina)的抗性中的应用。
5、在所述应用中，小麦中tarlk-1b蛋白的表达量和/或活性降低，小麦对叶锈菌的抗性减弱；小麦中tarlk-1b蛋白的表达量和/或活性提高，小麦对叶锈菌的抗性增强。
6、第三方面，本发明要求保护如下任一方法：
7、(a1)一种提高小麦对叶锈病的抗性的方法，包括如下步骤：促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高，从而提高小麦对叶锈病的抗性。
8、(a2)一种降低小麦对叶锈病的抗性的方法，包括如下步骤：抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性，从而降低小麦对叶锈病的抗性。
9、(a3)一种提高小麦对叶锈菌的抗性的方法，包括如下步骤：促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高，从而提高小麦对叶锈菌的抗性。
10、(a4)一种降低小麦对叶锈菌的抗性的方法，包括如下步骤：抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性，从而降低小麦对叶锈菌的抗性。
11、第四方面，本发明要求保护如下任一方法：
12、(b1)一种培育对叶锈病的抗性增强的小麦品种的方法，包括如下步骤：促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高，从而培育对叶锈病的抗性增强的小麦品种。
13、(b2)一种培育对叶锈病的抗性减弱的小麦品种的方法，包括如下步骤：抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性，从而培育对叶锈病的抗性减弱的小麦品种。
14、(b3)一种培育对叶锈菌的抗性增强的小麦品种的方法，包括如下步骤：促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高，从而培育对叶锈菌的抗性增强的小麦品种。
15、(b4)一种培育对叶锈菌的抗性减弱的小麦品种的方法，包括如下步骤：抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性，从而培育对叶锈菌的抗性减弱的小麦品种。
16、在前文第三方面和第四方面所述方法中，所述促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高以及所述抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性，具体可通过如下6种调控水平中至少一种实现：1)在基因转录水平上促进/抑制tarlk-1b蛋白的编码基因的表达；2)在基因转录后水平上促进/抑制tarlk-1b蛋白的编码基因表达(也就是通过对相关基因的初级转录物的剪接或加工实现促进/抑制tarlk-1b蛋白的表达)；3)在对基因的rna转运水平上促进/抑制tarlk-1b蛋白的表达(也就是通过对相关基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行调控实现促进/抑制tarlk-1b蛋白表达)；4)在对基因的翻译水平上进行调控实现促进/抑制tarlk-1b蛋白表达；5)在对基因的mrna降解水平上进行调控实现促进/抑制tarlk-1b蛋白表达；6)在对基因的翻译后水平上进行调控实现促进/抑制tarlk-1b蛋白活性。
17、进一步地，所述促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高可通过向小麦中导入tarlk-1b蛋白的编码基因实现；所述抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性可通过向小麦中导入靶向tarlk-1b蛋白的编码基因的基因编辑工具或sirna或shrna等方式实现。
18、在本发明的一个实施案例中，所述抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性通过crispr/cas9技术实现，即所述基因编辑工具为crispr/cas9编辑工具。进一步地，所述crispr/cas9编辑工具靶向tarlk-1b蛋白的编码基因，其靶序列如seq id no.3或seq idno.4所示。
19、在上述各相关方面中，所述tarlk-1b蛋白可为如下任一所示蛋白质：
20、(c1)氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质；
21、(c2)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于小麦的蛋白质；
22、(c3)与(c1)-(c2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于小麦的具有相同功能的蛋白质；
23、(c4)在(c1)-(c3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
24、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
25、所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
26、在上述各相关方面中，所述tarlk-1b蛋白的编码基因可为如下任一所示dna分子：
27、(d1)seq id no.2所示的dna分子；
28、(d2)在严格条件下与(d1)限定的dna分子杂交且编码所述tarlk-1b蛋白的dna分子；
29、(d3)与(d1)-(d2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述tarlk-1b蛋白的dna分子。
30、上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mna3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％ sds和1×ssc，0.1％ sds各洗膜一次。
31、上述基因中，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existencecost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
32、上述基因中，所述95％以上的同一性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
33、在本发明的一个实施案例中，所述叶锈菌(puccinia triticina)具体为叶锈菌生理小种tht。
34、在本发明的一个实施案例中，所述小麦具体为济麦38。
35、在本发明中，减弱(降低)小麦对叶锈病(菌)的抗性或者说培育对叶锈病(菌)的抗性减弱的小麦品种，可作为研究小麦对叶锈病抗性时的感病对照。
36、实验证明，敲除小麦中的tarlk-1b基因后，ko株系在叶片表面出现了部分孢子堆和大面积的坏死斑。因此，tarlk-1b功能丧失降低了小麦对叶锈菌的抗性，表明tarlk-1b正调控小麦抗叶锈病。本发明有助于增强小麦分子标记辅助抗病育种工作，后续对不同抗病机制的抗性基因进行优化选择、编辑和聚合，从而增强可持续性抗叶锈病，并加快培育抗叶锈病小麦新品种。
1.tarlk-1b蛋白或其编码基因在调控小麦对叶锈病的抗性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在所述应用中，小麦中tarlk-1b蛋白的表达量降低，小麦对叶锈病的抗性减弱；和/或，小麦中tarlk-1b蛋白的表达量提高，小麦对叶锈病的抗性增强。
3.tarlk-1b蛋白或其编码基因在调控小麦对叶锈菌的抗性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在所述应用中，小麦中tarlk-1b蛋白的表达量和/或活性降低，小麦对叶锈菌的抗性减弱；和/或，小麦中tarlk-1b蛋白的表达量和/或活性提高，小麦对叶锈菌的抗性增强。
5.如下任一方法：
6.如下任一方法：
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述促进小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性提高通过向小麦中导入tarlk-1b蛋白的编码基因实现；或，所述抑制小麦中tarlk-1b蛋白的表达和/或活性通过向小麦中导入靶向tarlk-1b蛋白的编码基因的基因编辑工具实现。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述基因编辑工具为crispr/cas9编辑工具；
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述tarlk-1b蛋白为如下任一所示蛋白质：
10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述tarlk-1b蛋白的编码基因为如下任一所示dna分子：
