本发明属于基因工程和生物，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌生产3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇的生物合成方法。
背景技术：
1、3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇(3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol,dhmba)，含有三个羟基，化学式为c8h10o4，是一种提取于滤食性双壳贝类的酚类有机化合物，具有强大的抗氧化作用。dhmba是一种难得的既具有速效的直接抗氧化剂，也具有可持续性抗氧化能力的间接抗氧化剂，由于其亲水亲油的特性，它可以渗透到油脂多的细胞膜和水分多的细胞内，在细胞深处的活性氧自由基也会被充分氧化消除。研究表明，dhmba的抗氧化活性约为代表性抗氧化物质维生素c的2.3倍，也是绿原酸的6倍。同时，dhmba的安全性(ic50)是姜黄素和番茄红素的5倍，是一种安全稳定的超级抗氧化剂。
2、在生理功能方面，dhmba对肝脏健康特别有益，可以保护肝细胞氧化应激引起的损伤和细胞凋亡，同时dhmba有助于谷氨酸能神经元活动的正常运作，有助于大脑的记忆和学习功能，减少情绪焦虑；其次，有助于降低体重和降低脂肪肝；还具有加速穿透血脑屏障，促进睡眠；提高记忆力，延缓老年痴呆；促进皮毛再生，预防脱发等功能。相关功效有大量的临床数据以及动物模型、细胞实验测试支撑。
3、综合来看，dhmba是一种功能强大且安全的抗氧化物质，在美妆日化、宠物饲料、保健品、医药等行业有巨大的发展前景。
4、专利申请号为cn201480081399.9的中国专利《从牡蛎肉生成3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇的生成方法》首次提到了利用牡蛎肉处理得到3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇，而该方法是将牡蛎肉直接在98℃以上的温度加热处理，或者加压后在90℃以上加热处理，属于dhmba的提取方法。专利申请号cn202310206016.7中国专利《发酵制备3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇的方法及该方法的应用》中提到了使用牡蛎肉进行发酵，获得了含有dhmba的牡蛎肉粉。由于dhmba本就是从牡蛎中发现的，此方法模仿了dhmba的天然产生方式，并不是通过基因工程方式合成dhmba。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌生产dhmba的生物合成方法。该方法通过基因工程手段，构建包含合成dhmba所需关键酶基因的重组质粒，并将其转化至枯草芽孢杆菌中，使其在含有莽草酸的培养基中进行生物合成，最终通过分离纯化得到dhmba。
2、为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种利用枯草芽孢杆菌生产dhmba的生物合成方法，包括以下步骤：
4、(1)构建含有羧酸还原酶和o-甲基转移酶基因的重组质粒；
5、(2)将所述重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中，获得重组枯草芽孢杆菌；
6、(3)在含有莽草酸的培养基中培养所述重组枯草芽孢杆菌；
7、(4)从培养基中分离纯化得到的dhmba。
8、所述的羧酸还原酶来源于链霉菌属，其编码基因为cara基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。
9、所述o-甲基转移酶来源于链霉菌属，其编码基因为omt基因，核苷酸序列如seq idno.2所示。
10、上述的生物合成方法中，具体代谢路径如下：
11、第一步，莽草酸在羧酸还原酶作用下转化为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-甲醛(dhba)；
12、第二步，3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-甲醛(dhba)在o-甲基转移酶作用下甲基化为dhmba。
13、步骤(3)中，所述培养的条件为：ph值为6.5-7.5，温度为32-40℃，时间为24-72h。
14、优选的，所述培养的条件为：ph值为6.5-7.5，温度为34-36℃，时间为48-60h。
15、步骤(3)中，所述培养基组成为：葡萄糖20-30g/l、酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水。
16、步骤(3)中，所述莽草酸在培养基的浓度为1-10g/l。
17、优选的，所述莽草酸在培养基的浓度为6-8g/l。
18、步骤(4)中，所述分离纯化是使用高效液相色谱法进行分离纯化。
19、本发明还提供上述利用枯草芽孢杆菌生产dhmba的生物合成方法在制备dhmba中的应用。
20、本发明首次提出一种dhmba的生物合成方法，该方法通过基因工程手段，构建包含合成dhmba所需关键酶基因的重组质粒，并将其转化至枯草芽孢杆菌中，使其在含有莽草酸的培养基中进行生物合成，最终通过分离纯化得到dhmba。该方法具有高效、经济、环保的特点，适用于工业化生产。
1.一种利用枯草芽孢杆菌生产3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述羧酸还原酶的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述o-甲基转移酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，其具体代谢路径如下：
4.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述培养的条件为：ph值为6.5-7.5，温度为32-40℃，时间为24-72h。
5.根据权利要求4所述的生物合成方法，其特征在于，所述培养的条件为：ph值为6.5-7.5，温度为34-36℃，时间为48-60h。
6.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述培养基组成为：葡萄糖20-30g/l、酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水。
7.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述莽草酸在培养基的浓度为1-10g/l。
8.根据权利要求7所述的生物合成方法，其特征在于，所述莽草酸在培养基的浓度为6-8g/l。
9.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述分离纯化是使用高效液相色谱法进行分离纯化。
10.权利要求1-9任一项所述的利用枯草芽孢杆菌生产3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇的生物合成方法在制备3,5-二羟基-4-甲氧基苄醇中的应用。
