本发明涉及一种大肠杆菌整合表达体系及其在酶高效表达中的应用，属于合成生物学。
背景技术：
1、由于人们对绿色制造，生物制造的迫切需求，生物工程被越来越广泛地关注。很多技术例如基因工程，蛋白质工程以及合成生物学蓬勃发展，并逐渐走向成熟。微生物作为基因表达与调控的宿主发挥着重要作用。在这些领域中，由于质粒实验操作便利及产量高的优势，人们通常以质粒作为载体，进行基因或途径的表达。但是，质粒型表达体系存在着两个主要的弊端。首先是，质粒作为非基因组dna，通常表现出遗传稳定性差(质粒丢失)的问题，导致重组菌在发酵后期产量下降或难以提升。此外，质粒在宿主细胞内的维持往往需要添加抗生素。然而抗生素的滥用以及环境中的引入很可能会导致抗生素耐受的细菌出现，甚至进化出超级细菌。这也被认为是当今世界最大的卫生问题之一。并且，在工业化生产规模，抗生素的大量使用无疑会增加更多的成本。
2、将外源基因整合到宿主的染色体进行表达可以很好地避免质粒表达的几种弊端。首先，基因插入到基因组上不需要任何的抗性筛选就能够持续并且稳定的表达。此外，基因在宿主中整合表达后，不需要添加维持质粒在细胞中的复制，因此显著减少了宿主细胞的生长和代谢压力。并且，伴随着基因编辑技术的飞速发展，越来越多的基因编辑技术被开发出来，例如crispr-cas9，crispr-cpf1以及transposon-associated crispr-cas system等。这些为整合表达提供了多元化并且方便的技术策略。整合表达相比较质粒游离表达表现出多种优势，但还存在表达量不足的明显弊端。很多学者通过多拷贝数整合基因组，通过增加基因剂量以提升表达量。例如，zhang等人将2个拷贝数的nad激酶基因整合到大肠杆菌的基因组上以提升聚-3-羟基丁酸酯的产量(zhang et al.biotechnol lett,2015)。此外，watzlawick等人将5个拷贝数的gana基因表达盒插入到枯草芽孢杆菌的基因组中，实现了β-半乳糖苷酶的高效表达以及稳定遗传(watzlawick andaltenbuchner,amb express,2019)。然而，尽管多拷贝数整合能够显著提升基因在基因组水平的表达量，但其实验过程繁琐，且基因组中的多拷贝数基因表达盒会给宿主带来显著的生长负担。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明通过整合位点的筛选、目的基因启动子的优化以及t7rna聚合酶调控原件的改造，提供了一种可实现高效整合表达的大肠杆菌体系，并采用编码不同酶的目的基因进行验证，确定了该体系高效表达外源基因的可行性。
2、本发明的第一个目的是提供一种高效整合表达目的基因的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包括以下改造：在大肠杆菌宿主基因组的slma位点整合目的基因表达框，并将基因组上t7rna聚合酶编码基因的调控原件进行替换；
3、所述目的基因表达框中含有目的基因以及启动所述目的基因表达的第一启动子，所述第一启动子为串联启动子，所述串联启动子通过plpp启动子、pgapa启动子、pssra启动子中的一种或几种与t7启动子串联得到，
4、所述调控原件包括位于t7rna聚合酶编码基因上游的乳糖操纵子，将所述调控原件替换为含有第二启动子的原件，所述第二启动子选自palsr启动子或pasnb启动子。
5、由于质粒介导的微生物发酵存在额外的生长负担、遗传不稳定和抗生素污染等缺点，在基因组水平上增强外源基因的表达至关重要，因此本发明的目的是构建基因组水平单拷贝数的高效整合表达体系，以实现非抗生素依赖的遗传稳定性的高效重组表达。大肠杆菌由于其遗传操作便利，表达能力强而受到研究者的青睐。因此，本发明中，我们以大肠杆菌bl21(de3)作为模式菌株。为了进一步降低重组表达成本，我们致力于构建组成型高效整合表达体系以避免ipig的添加成本。很多学者在先前的研究中已经证明，基因在染色体上不同的位置，其表达水平会表现出显著的差异。bryant在研究中证明，在相同的表达盒中，绿色荧光蛋白在大肠杆菌基因组上能表现出300倍的表达差异(bryant etal.nucleicacids res,2014)。因此，我们在研究中在大肠杆菌染色体的oristructuredmacrodomain区域挑选了18个整合位点，并通过对这18个整合位点的表达强度表征，挖掘到一个表达活性最高的位点slma。在此基础上，为进一步提升整合表达量，我们又对表达盒中的启动子元件进行设计。我们先表征了大肠杆菌的16个组成型启动子。接着又将这16个启动子与t7启动子进行组合，构建了16个双启动子以及10个三启动子。在这一系列启动子库中挖掘到了一个高强度启动子plpp-t7，在组成型表达情况下，其表达强度是t7启动子的3.3倍。之后，我们将高强度plpp-t7启动子结合高表达活性位点slma，整合表达量能够达到质粒pet-3b表达量的74％。为了实现强度更高的组成型整合表达，我们又进一步对大肠杆菌bl21(de3)基因组中的t7rna聚合酶(乳糖操纵子渗漏型表达)进行组成型表达调控。成功使得egfp的整合表达量达到了质粒水平的1.98倍。到此，构建组成型高效整合表达体系。最后，我们还利用构建的体系对腈水解酶和透明质酸酶进行整合表达。得到的整合菌株酶活力和表达量都能够达到与质粒相当的水平。
6、进一步地，所述串联启动子中，plpp启动子、pgapa启动子或pssra启动子位于t7启动子之前。
7、优选地，所述串联启动子包括plpp启动子、pgapa启动子、pssra启动子、plpp-t7启动子、pgapa-t7启动子、pssra-t7启动子、pgapa-plpp-t7启动子、pgapa-pssra-t7启动子、plpp-pgapa-t7启动子、plpp-pssra-t7启动子、pssra-pgapa-t7启动子或pssra-plpp-t7启动子。本发明实施例的各串联启动子中，启动子之间直接连接。
8、进一步地，所述目的基因表达框和/或含有第二启动子的原件中还含有rbs；所述rbs的序列如seq id no.12所示。
9、进一步地，所述slma位点如seq id no.1所示。
10、进一步地，通过crispr-cas9技术进行整合，整合至slma位点所需的编辑原件包括sgrna；所述sgrna的序列如seq id no.2所示。
11、进一步地，所述plpp启动子、pgapa启动子、pssra启动子的序列分别如seq idno.3-5所示，t7启动子的序列如seq id no.6所示。
12、进一步地，所述调控原件的序列如seq id no.7所示。
13、进一步地，所述palsr启动子、pasnb启动子的序列分别如seq id no.8-9所示。
14、进一步地，所述大肠杆菌宿主包括大肠杆菌bl21(de3)。
15、本发明的第二个目的是提供一种高表达强度的组成型双启动子，所述组成型双启动子由plpp启动子直接连接在t7启动子之前得到。
16、本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌或组成型双启动子在整合表达目的基因中的应用。
17、进一步地，所述目的基因为外源蛋白(酶)的编码基因，包括但不限于腈水解酶、透明质酸酶等。
18、进一步地，所述腈水解酶的序列如seq id no.10所示；所述透明质酸酶的序列如seq id no.11所示。
19、本发明的第四个目的是提供一种高效整合表达目的基因的方法，包括采用所述重组大肠杆菌进行发酵的步骤。
20、具体地，本发明提供了一种大肠杆菌高效整合型表达体系ceies_ecoli，其结合plpp-t7启动子、基因组整合位点slma以及高整合表达强度大肠杆菌底盘细胞bslg-alsr，构建整合型表达体系，实现大肠杆菌高效组成型整合表达。
21、优选地，采用大肠杆菌高效整合型表达体系ceies_ecoli实现对pseudomonasputida cgmcc3830来源腈水解酶的整合型表达，且酶活力能够达到22.87u·ml-1。
22、优选地，采用大肠杆菌高效整合型表达体系ceies_ecoli实现对citrobacterfreundii来源的透明质酸酶的整合型表达，且酶活力能够达到12195u·ml-1。
23、本发明的有益效果：
24、(1)本发明以大肠杆菌作为模式菌株，通过原件的筛选和优化构建了基因组水平单拷贝数的高效整合表达体系，实现了非抗生素依赖的遗传稳定性的高效重组表达，成功使得报告基因的整合表达量达到了质粒水平的1.98倍和2.07倍。同时，利用构建的体系对腈水解酶和透明质酸酶进行整合表达，得到的整合菌株酶活力和表达量都能够达到与质粒相当的水平。
25、(2)本发明中构建的高效整合表达体系能够在无抗生素、无诱导剂添加情况下，实现高效的蛋白重组表达，并且具有显著优越的遗传稳定性。在减少发酵成本的情况下，从根本上避免了抗生素残留、抗生素滥用以及污染问题。
1.一种整合表达目的基因的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包括以下改造：在大肠杆菌宿主基因组的slma位点整合目的基因表达框，并将基因组上t7rna聚合酶编码基因的调控原件进行替换；
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述串联启动子中，plpp启动子、pgapa启动子或pssra启动子位于t7启动子之前；所述串联启动子包括plpp启动子、pgapa启动子、pssra启动子、plpp-t7启动子、pgapa-t7启动子、pssra-t7启动子、pgapa-plpp-t7启动子、pgapa-pssra-t7启动子、plpp-pgapa-t7启动子、plpp-pssra-t7启动子、pssra-pgapa-t7启动子或pssra-plpp-t7启动子。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述目的基因表达框和/或含有第二启动子的原件中还含有rbs；所述rbs的序列如seq id no.12所示。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，通过crispr进行整合；整合至slma位点所需的编辑原件包括sgrna；所述sgrna的序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌宿主包括大肠杆菌bl21(de3)。
6.一种组成型双启动子，其特征在于，所述组成型双启动子由plpp启动子连接在t7启动子之前得到。
7.含有权利要求6所述组成型双启动子的大肠杆菌。
8.权利要求1-5任一项所述的重组大肠杆菌、权利要求6所述的组成型双启动子或权利要求7所述的大肠杆菌在整合表达目的基因中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述目的基因包括酶的编码基因；所述酶包括腈水解酶或透明质酸酶。
10.一种整合表达目的基因的方法，其特征在于，包括采用权利要求1-5任一项所述的重组大肠杆菌进行表达的步骤。
