本发明属于植物基因工程，尤其涉及大豆gmmpk4、gmice2与gmpr1基因、重组表达载体及其转化体在防治大豆疫霉根腐病中的应用。
背景技术：
1、大豆疫霉根腐病(phytophthoraroot and stemrot ofsoybean)是由大豆疫霉菌(phytophthora sojae kaufmann&gerdemann)引起的导致大豆根腐和茎腐的病害，是世界范围内毁灭性的病害之一，给大豆生产造成了严重威胁。大豆疫霉菌的变异性高，随着新种群数量的增加和毒力的分化，抗性品种容易失去抗性。因此，抗病基因工程育种是解决该难题的良好途径之一。
2、促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，简称mapk)，通过mapkkk-mapkk-mapk级联逐级磷酸化将受体感知的外界刺激传递至细胞内，使细胞对外源信号产生特异性的生理反应以适应外界所带来的生物与非生物胁迫。mapk激酶可响应各种非生物应激，从而被激活，包括臭氧，干旱，高温，重金属，氧化应激，盐，冷，接触与水分胁迫，紫外线和营养吸收。除此之外，在生物胁迫方面mapks通过调控多重防御反应来抵抗病原菌的入侵，包括防御基因激活、植物先天免疫、气孔关闭、活性氧产生、过敏性反应和整体抗病性。mapk级联在植物的免疫中起到重要的作用，了解它的级联网络系统对我们进一步了解植物具有重要的意义。
3、mapk级联磷酸化是植物免疫反应的关键组成部分。在拟南芥、水稻、小麦、番茄、烟草等植物中，mapk级联信号通路已被确定为重要的磷酸化信号通路。目前已在多种植物中鉴定出mapk基因，拟南芥基因组中有mapk基因20个，水稻中有17个，杨树中有21个，小麦中有15个，番茄中有16个，玉米中有21个，烟草中17个。mapk级联途径通过磷酸化底物并诱导抗性基因的表达。许多转录因子已被确定为生物胁迫与非生物胁迫应答过程中mapk级联的底物，包括bhlh转录因子。gmice2属于bhlh转录因子，bhlh转录因子在植物对冷胁迫的响应以及抗逆中发挥着重要的作用。
4、pr(pathogenesis-relatedgenes)基因是植物防御反应过程中产生最多的基因之一，在植物对病原菌的防御反应中起到关键作用。在多种植物中过表达pr1、pr2或pr3均提高了对多种病原菌的抗性。在卵菌大豆疫霉菌防御反应中pr基因作为转录因子的下游靶基因可以增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。
5、植物防御反应的调控发生在从转录的积累和调节到蛋白的翻译和修饰等各个层面，涉及免疫反应蛋白、转录调节因子和防御相关基因等多种调节机制的参与和协调。迄今为止，大豆对大豆疫霉菌的分子防御机制尚不明晰。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆gmmpk4、gmice2与gmpr1基因、重组表达载体及其转化体在防治大豆疫霉根腐病中的应用。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种大豆gmmpk4基因，所述大豆gmmpk4基因的核苷酸序列如seq idno.1所示，具体为atgtctgttgttgagtcaggtgaacacaacaacatcagaggagtacctactcatggtggacgctatgttcagtacaatatctatggcaatctctttgaagtttccagaaagtatgtccctcctattcgccctgtgggtagaggcgcttatggtattgtttgcgctgctgtaaatgcagagacaggtgaggaagttgccattaagaagattggcaatgcatttgataacagaatagatgccaaaaggaccttacgagaaattaaacttcttcggcacatggatcatgcaaatattatgtccattaaagatattatacgtcctccacagaaggaaaacttcaatgatgtgtaccttgtttctgagttaatggacacagatctgcatcaaataatacgttctaatcagcaattgactgatgatcattgtcggtattttctgtatcaattgttacgagggctcaaatatgtacattcagcaaatgttttgcaccgtgatctaaagcctagtaatttgctattgaatgccaattgtgaccttaagattgcggactttggtcttgctagaactacatctgaaactgactttatgactgagtatgtggtcactagatggtaccgtgctcccgaattgcttcttaattgttcagaatatacagcagccattgatatatggtctgttggttgcatacttggtgaaatcataaccagacaaccactctttcctggcaaagattatgttcatcagctgagacttatcacagagctgataggttcacccaatgatgccagccttggatttctacgaagtgataatgctcgtagatatgtaaaacagcttccccaatatccaaagcaaaacttttctgctagatttcccgacatgtctcctggtgcagttgatttgctagagaagatgctcatctttgatccaaacaggcgaattacagttgatgaggcgttgagccacccatacatggcacctctccatgacatcaatgaggaacctgtttgcaccagacctttcagttttgactttgagcaaccatcattcactgaagaagacatcaaggaactcatctggagagaatctgtgaagttcaatcctgttccaccagtctactga。
4、本发明还提供了所述的gmmpk4基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为msvvesgehnnirgvpthggryvqyniygnlfevsrkyvppirpvgrgaygivcaavnaetgeevaikkignafdnridakrtlreikllrhmdhanimsikdiirppqkenfndvylvselmdtdlhqiirsnqqltddhcryflyqllrglkyvhsanvlhrdlkpsnlllnancdlkiadfglarttsetdfmteyvvtrwyrapelllncseytaaidiwsvgcilgeiitrqplfpgkdyvhqlrliteligspndaslgflrsdnarryvkqlpqypkqnfsarfpdmspgavdllekmlifdpnrritvdealshpymaplhdineepvctrpfsfdfeqpsfteedikeliwresvkfnpvppvy。
5、本发明还提供了过表达所述的大豆gmmpk4基因在增强作物对大豆疫霉根腐菌敏感性中的应用。
6、本发明还提供了过表达所述的大豆gmmpk4基因在磷酸化降解作物中抗病蛋白gmice2中的应用。
7、本发明还提供了一种大豆gmice2基因，所述大豆gmice2基因的核苷酸序列如seqid no.3所示，具体为atgaatatggagcgctacacgctaccggcaccacccaatattattcccgaggaagaagaaaacattgccattgccatgggtgcccctcttatcccttcctttaaatccatgcttcaacaacaccctcaacaacttgactcttactttaactcttcaattagttctactactatcccttttgttcctaacatggactcttttctctctcttgaccctttctcaccttctttcttcaacaacagcagcagcagcagcaacatggccctcgacccgggttttgatttgggcctggacactgggcttcactcttctgctcctgctccccatcttttttcccaggcccagatgatgggcttcgagttctcggagctcgaagccctggctggacctgggaatgtaaatgtcccgtttgcggacggggcaaaggcggctgctctgctgcggtctcctcatttcgagccgccgcagcagcagccgacgctgtaccggaagcggagggggacagccgcggagattccggggctggagatggtgagaaggaaggggaggaagtggcaggaaggaggaggggagggtgaggaagggagcagtgctgacgtgggcggttccgggttgaactatgagtctgatgagcagaatgagagcaatgggttgaagctgagtgagaatggtggagataacaaggggaagaagaaggggctgcccgccaagaatctcatggcggagaggcgccgccggaagaagctcaatgataggttgtacatgctcaggtctgttgtccccaagattagcaagatggatagggcttcaatacttggggatgcaattgactacttgaaggagttgctgcagcggattaatgatcttcatcacgagctggagtcaactccacctggctcgtcgctgacaccttcttcttctacaagctttcagcctttaacacccaccctgccaacccttccctgtcgggtcaaggaggaactgtatcctggcaccttgccaagccctaaaaaccaagctgcaaaggttgaggttagagtaagggaagggagaactgtcaacattcatatgttctgcacccgccgaccaggtcttttgctttctaccatgaaggctttggataacctcggattggatgtacagcaggctgttattagctgttttaatggctttgctttagatgtgttcaaagctgagcaatgcagagaaggccaggatgtcctccctgagcaaattaaagcggtgctctcggattctgctggcttccatggtatgatgtga。
8、本发明还提供了所述的gmice2基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示，具体为mnmerytlpappniipeeeeniaiamgaplipsfksmlqqhpqqldsyfnssissttipfvpnmdsflsldpfspsffnnsssssnmaldpgfdlgldtglhssapaphlfsqaqmmgfefselealagpgnvnvpfadgakaaallrsphfeppqqqptlyrkrrgtaaeipglemvrrkgrkwqegggegeegssadvggsglnyesdeqnesnglklsenggdnkgkkkglpaknlmaerrrrkklndrlymlrsvvpkiskmdrasilgdaidylkellqrindlhhelestppgssltpssstsfqpltptlptlpcrvkeelypgtlpspknqaakvevrvregrtvnihmfctrrpglllstmkaldnlgldvqqaviscfngfaldvfkaeqcregqdvlpeqikavlsdsagfhgmm。
9、本发明还提供了过表达所述的大豆gmice2基因在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
10、本发明还提供了过表达所述的大豆gmice2基因在提高作物中增强抗病途径相关基因gmpr1的转录中的应用。
11、本发明还提供了一种重组表达载体，包括目的基因和pcambia3301过表达载体，所述目的基因为大豆gmice2或gmpr1基因；所述gmpr1基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，具体为atggggtacatgtgcattaagatttcgttttgtgtgatgtgtgtgttggggttggtgatcgtgggtgatgttgcctacgctcaagattcagcagaagactacgtgaatgcacacaatgcagcacgagcagaggtgggttctcaatcaccaagacaaacagtgattgttccaagtttggcttgggatgatacggttgctgcttatgcagagagctatgctaatcaacgcaaaggtgactgccaactgatccactctggtggtgaatacggagagaatattgcaatgagcactggtgaactaagtggcacagatgcagtgaaaatgtgggttgatgagaaatccaactatgactatgattctaactcttgtgttggaggagagtgcctgcactacacacaggtcgtttgggctaactcggtgcgtcttggatgtgccaaagtgacatgtgataacggaggcactttcatcacttgcaactatgatccccctggcaactttgttggtgaaagaccctacaaactgtag；所述大豆gmpr1基因编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.6所示。所述氨基酸序列为：mgymcikisfcvmcvlglvivgdvayaqdsaedyvnahnaaraevgsqsprqtvivpslawddtv aayaesyanqrkgdcqlihsggeygeniamstgelsgtdavkmwvdeksnydydsnscvggeclh ytqvvwansvrlgcakvtcdnggtfitcnydppgnfvgerpykl；
12、所述重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：
13、1)对pcambia3301过表达载体进行线性化处理，获得线性化表达载体pcambia3301；
14、2)将大豆gmice2或gmpr1基因分别连接至peasy-blunt载体上，再转化至大肠杆菌感受态细胞中扩繁，获得peasy-blunt-gmice2或peasy-blunt-gmpr1；
15、3)以获得的peasy-blunt-gmice2或peasy-blunt-gmpr1为模板，设计两端带有载体末端序列的特异性引物，并通过pcr扩增出gmice2或gmpr1基因的目的片段；
16、4)将目的片段插入线性化表达载体pcambia3301中，获得过表达大豆gmice2或gmpr1基因的重组表达载体。
17、本发明还提供了一种过表达大豆gmice2或gmpr1基因的转化体，将过表达大豆gmice2或gmpr1基因导入大肠杆菌中；所述大肠杆菌为trans1-t1感受态细胞。
18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
19、本发明通过实验研究发现，大豆gmmpk4基因能够增强大豆对大豆疫霉根腐病的敏感性，主要通过gmmpk4磷酸化gmice2，促进gmice2的蛋白降解抑制其对gmpr1的转录调控，从而增强大豆对大豆疫霉根腐病的敏感性。过表达大豆gmice2能够增强大豆对大豆疫霉根腐病的抗性，gmice2通过促进抗病基因gmpr1的表达增强大豆对大豆疫霉根腐病的防御能力。该发现为研究抗大豆疫霉根腐病的相关机制提供了重要的基因基础及理论支持，为推进植物防御系统的研究和应用以及培育高抗病的大豆新品种提供了宝贵的基因资源，在大豆抗病基因工程育种中具有重要的应用价值。
1.一种大豆gmmpk4基因，其特征在于，所述大豆gmmpk4基因的核苷酸序列如seq idno.1所示。
2.权利要求1所述的gmmpk4基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.过表达权利要求1所述的大豆gmmpk4基因在增强作物对大豆疫霉根腐菌敏感性中的应用。
4.过表达权利要求1所述的大豆gmmpk4基因在磷酸化降解作物中抗病蛋白gmice2中的应用。
5.一种大豆gmice2基因，其特征在于，所述大豆gmice2基因的核苷酸序列如seq idno.3所示。
6.权利要求5所述的gmice2基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.4所示。
7.过表达权利要求5所述的大豆gmice2基因在提高作物对大豆疫霉根腐病抗性中的应用。
8.过表达权利要求5所述的大豆gmice2基因在提高作物中增强抗病途径相关基因gmpr1的转录中的应用。
9.一种重组表达载体，其特征在于，包括目的基因和pcambia3301过表达载体，所述目的基因为大豆gmice2或gmpr1基因；
10.一种过表达大豆gmice2或gmpr1基因的转化体，其特征在于，将过表达大豆gmice2或gmpr1基因导入大肠杆菌中；所述大肠杆菌为trans1-t1感受态细胞。
