本发明属于分析化学领域，具体涉及一种三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备及其高通量同时检测多种食源性致病菌中的应用。
背景技术：
1、由食源性致病菌(如沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏菌)引起的食源性疾病对食品安全构成持续挑战，这是一个广泛且代价高昂的全球公共卫生问题。这些细菌在食物和水中的低传染剂量会导致许多严重甚至致命的疾病。大肠杆菌o157:h7作为一种重要的食源性致病菌,感染后可引起出血性腹泻、出血性结肠炎、腹膜炎和溶血性尿毒症综合征等疾病,严重的情况下甚至可导致死亡。人类被沙门氏菌感染后很容易引起发热、腹泻、呕吐等症状。在畜禽动物中，仔猪和犊牛易受到侵袭，其感染导致幼畜发育不良，死亡率飙升，给世界各国猪和牛的养殖造成极大的经济损失。沙门氏菌是一种高度拟合的环境微生物，可在土壤、灰尘、海洋地表水中持续存在,伺机侵袭易感动物。上述两种病原菌严重阻碍了畜牧养殖业的持续健康发展。人类对志贺氏菌具有较高的感染性，感染后的症状包括腹泻、发烧、痉挛，严重时可导致死亡，特别是婴幼儿，一旦发生急性细菌性痢疾，死亡率甚高。志贺氏菌在很多国家都造成了严重的公共卫生问题，志贺氏菌可以通过食物、水、粪口、接触等多种方式传播，在食品生产、加工的各个环节中均易受到志贺氏菌污染，对食品造成潜在的风险与威胁。快速控制和预防食源性致病菌引起的疾病是目前各国面临的食品安全监管问题之一，受到社会各界的广泛关注。为了保障食品安全和公众健康，迫切需要高效、快速的细菌检测技术。由于常用方法步骤复杂、耗时、灵敏度低或选择性差等局限性，开发快速可靠的食源性致病菌检测方法仍然是食品安全和公共卫生的热门研究领域。
2、分子印迹技术作为一种能够特异性、选择性地识别真实样品中的模板分子的材料，在食品样品分析中得到了广泛的应用。分子印迹聚合物(molecular imprintingpolymers，mips)是模板分子与功能单体通过共价键、范德华力、氢键、疏水作用等相互作用力在交联剂和引发剂的作用，发生聚合反应，洗脱模板后，形成的聚合物，具有能在大小、形态和化学作用方面特异性识别模板的三维孔穴结构。传统的微生物检测方法，包括传统培养鉴定法、免疫学检测方法、分子生物学技术等，这些方法对操作人员要求较高，耗时费力和试剂价格昂贵，因此严重阻碍了感染链的抑制和疾病的治疗。因此，能够快速识别致病菌的先进检测技术是促进感染诊断和精准医疗的理想选择。分子印迹技术提供了一种有希望的替代方法，因为它可以特异性地检测微生物并在短时间内给出定性结果，通过克服耗时的生长培养和复杂的样品处理问题，可以显著加快检测时间，具有高灵敏度。在过去的十年中，大量的分子印迹聚合物(mips)被研究和报道。各种模板已被成功开发和使用，在分离、吸附、催化、传感和药物传递方面取得了重大进展。在所有模板中，小分子在mip的合成中占主导地位。相比之下，生物大分子印迹技术的发展受到显著阻碍，这主要源于生物大分子本身的特性，如大小、结构的复杂性以及构象的脆弱性，这些因素给印迹过程带来了极大的挑战。另外，尽管微生物与印迹空腔的自由结合对于分子印迹聚合物(mips)材料在分离或传感技术中的应用前景广阔，但这一领域仍需深入研究。尽管微生物表面印迹技术被视为提高微生物结合效率的有效手段，但现有的方法仍需进一步优化。在尝试将微生物印迹技术集成化，以进一步提升分析性能时，技术和设备的小型化成为了一个潜在的制约因素。因此，为了推动生物大分子印迹技术的进一步发展，我们需要深入探究并解决这些关键问题。
技术实现思路
1、发明目的：针对现有常规检测技术存在的问题，本发明提供了一种三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片，本发明构建的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片利用三维光子晶体微球和分子印迹技术两者结合对三种食源性致病菌进行同时检测，有效解决了对食源性致病菌的传统检测方法中操作繁琐，耗时耗力，成本高，易出现交叉反应等问题。
2、本发明还提供了三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片及其应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)将模板菌加入缓冲液中，再加入功能单体和荧光单体进行预组装，获得分子印迹预聚液，再依次加入光子晶体微球、交联剂，合成三维全细胞分子印迹聚合物；
5、(2)用洗脱溶液去除步骤(1)中的模板菌，得到能够特异性识别目标细菌的分子印迹光子晶体微球；将得到分子印迹光子晶体微球进行排列组装成芯片；具体使用时，将分子印迹光子晶体微球与待检测的目标菌株混合，反应结束后将得到的待检测的三维全细胞分子印迹光子晶体微球置于表面涂有pdms的载玻片上阵列式排布组成芯片。
6、作为优选，(1)将浓度为106-109cfu/ml的模板菌加入溶液中，再加入功能单体和荧光单体进行预组装，获得分子印迹预聚液；
7、(2)向步骤(1)制备的分子印迹预聚液中依次加入交联剂和三维光子晶体微球，置于脱色摇床中震荡，在微球表面合成印记层；
8、(3)用洗脱溶液去除(2)中的模板菌，得到能够特异性识别目标细菌的分子印迹光子晶体微球；
9、(4)将表面含能够特异性识别模板菌印迹层的三维光子晶体微球暴露在菌液环境中进行反应，与待检测的目标菌株混合，三维光子晶体微球能够识别并捕获细菌于其表面；
10、(5)步骤(4)反应结束后清洗微球去除物理吸附于微球表面的目标菌株；
11、(6)将微球置于载玻片上，按照阵列式排列，组成芯片，采集每个微球的荧光，对光子晶体微球的平均荧光值进行计算，从而对待检测的细菌进行定量定性检测。
12、其中，步骤(1)中所述模板菌为大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、志贺氏菌中的任意一种或者多种，模板菌液的浓度为106-109cfu/ml，所述溶液为磷酸盐缓冲液。
13、作为优选，所述溶液为磷酸盐缓冲液，其ph值为8.5，在碱性环境中模板菌可与功能单体通过共价结合形成模板-单体复合物。
14、其中，步骤(1)中功能单体为硅烷化的3-甲酰基苯硼酸，基于苯硼酸的硼酸基团在碱性条件下可以和细菌表面的顺式二羟基化合物形成共价的五元或六元环状酯，作为功能基团可特异性识别细菌，添加功能单体的浓度为2-5μmol/ml。
15、作为优选，选择3-甲酰基苯硼酸硅烷化试剂作为功能单体，通过3-甲酰基苯硼酸和氨基硅烷化试剂按照摩尔比1:1在乙醇中一步反应获得，得到的功能单体不需要进一步纯化。在碱性环境中，其硼酸基团可与细菌表面的顺势二羟基结合生成共价的环状酯。
16、其中，步骤(1)中荧光单体为硅烷化的异硫氰酸酯荧光素，添加浓度为70-90nmol/ml，优选80nmol/ml。基于光诱导电子转移(pet)机制，以有机荧光染料异硫氰酸荧光素(fitc)为荧光响应元件，利用aptes将其改性，后续可与模板形成复合物后，嫁接到光子晶体微球表面。
17、其中，步骤(1)中光子晶体微球由微流控平台制备；所述交联剂为原硅酸四乙酯，添加浓度为30-120μmol/ml，通过光子晶体微球表面修饰的氨基引发聚合反应的发生，无需额外添加引发剂，利用光子晶体微球作为载体，采用表面印迹的方式，使印记层在微球表面聚合。
18、作为优选，步骤(1)选择用表面修饰氨基的光子晶体微球，修饰氨基的微球可代替引发剂，在微球表面催化反应的发生，使印记层聚合在微球表面。
19、其中，步骤(2)中使用的洗脱液为醋酸-甲醇/水混合液，当环境变为酸性时，硼酸基团与细菌表面的顺式二羟基化合物形成的环状酯会发生离解，通过ph的切换实现对目标物的抓取和释放。
20、作为优选，洗脱溶液选择醋酸-甲醇/水混合液(6/4，v/v)洗脱模板，每次加入3ml，每小时换一次，直至使用紫外分光光度计无法检出模板分子，确保模板从合成的聚合物中完全去除。最后用乙醇和蒸馏水清洗两到三次，洗去聚合物表面的洗脱液。
21、本发明所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法所制备的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片。
22、本发明所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片在高通量同时检测多种食源性致病菌中的应用。
23、其中，所述应用为将三维全细胞分子印迹光子晶体微球与待检测的目标菌株混合，反应结束后，用缓冲液冲洗三维全细胞分子印迹光子晶体微球2-3次；将待检测的三维全细胞分子印迹光子晶体微球置于表面涂有pdms的载玻片上组成芯片采集捕获细菌后的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片中每个微球的荧光强度，与空白组对照，对三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片荧光强度的变化进行计算，实现对食源性致病菌的快速检测。
24、其中，所述高通量同时检测多种食源性致病菌是以荧光信号源为响应元件，分子印迹层为特异性识别元件，将分子印迹聚合物的高选择性与荧光检测的高灵敏度结合，弥补了分子印迹仅能识别但不能传输信号的缺陷；当反应体系中有目标菌株存在时，分子印迹聚合物通过多重相互作用机制，实现对细菌的高效识别，合成的分子印迹材料不透明且厚度较大，荧光激发光的穿透力会受到限制，由于细菌的存在，激发光会被生物组织高度散射和吸收，使得那些被细菌覆盖的荧光分子无法被有效激发，进而产生了荧光淬灭的现象，通过荧光强度的变化来实现对目标菌株的检测。
25、进一步地，将pdms与固化剂混合，然后涂在与晶芯微阵列芯片扫描仪相匹配的载玻片上，固化后，将待检测的三维全细胞分子印迹光子晶体微球置于表面涂有pdms的载玻片上组成芯片，使用晶芯微阵列芯片扫描仪对芯片上捕获了细菌的微球进行荧光信号采集，一次并行对大量样品进行同时测定，实现高通量检测。
26、作为优选，利用晶芯微阵列芯片扫描仪采集微球表面的荧光信号，该仪器可同时扫描多个样品，根据荧光强度的变化，实现对细菌的定量分析。
27、作为优选，所述检测食源性致病菌方法中利用表面印记策略合成三种食源性致病菌(大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、志贺氏菌)的荧光分子印迹聚合物，识别并捕获细菌于三维光子晶体微球表面。
28、本发明分别以三种食源性致病菌(大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、志贺氏菌)为模板，克服了以蛋白质等生物分子为模板的缺点，以苯硼酸硅烷化试剂为功能单体，利用硼酸的亲和反应原理，能够对目标菌进行特异性识别。基于硅烷化试剂的溶胶凝胶聚合反应，采用表面印记策略制备出三种食源性致病菌的分子印迹荧光微球，制备简单，成本低。本发明为开发食源性致病菌快速检测分析方法，提供了新型的分子识别材料，具有良好的实际应用前景。
29、不同于现有的分子印迹光子晶体微球的毒素检测，即使将毒素替换成模版菌也无法进行检测。本发明采用特定的单体以及合成体系，首次实现了利用三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片进行食源性致病菌的检测。本发明构建的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片能够高通量同时检测三种食源性致病菌(大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌和志贺氏菌)，可以通过荧光信号变化进行细菌的定量分析。本发明制备的分子印迹光子晶体微球芯片是以三维光子晶体微球作为捕获载体，微球表面的印迹层作为捕获菌株的工具。其中，利用表面印迹策略合成三种典型的食源性致病菌的分子印迹光子晶体微球。以待检测的目标菌株作为模板，硅烷化的3-甲酰基苯硼酸作为功能单体，硼酸基团可以结合细菌表面的肽聚糖，在碱性环境中模板与功能单体通过共价结合形成模板-单体复合物，接着引入荧光单体，三种相互作用形成复合物。而后加入交联剂和表面修饰氨基的光子晶体微球，微球表面修饰的氨基可引发反应在其表面发生，形成一层致密的印迹聚合物膜。反应结束后，利用酸性洗脱液洗脱模板，模板除去后的光子晶体微球表面便留下了与待检测的目标菌株结构类似的印迹空腔，以荧光信号源为响应元件，分子印迹层为特异性识别元件，将mips的高选择性与荧光检测的高灵敏度结合，弥补了分子印迹仅能识别但不能传输信号的缺陷。当反应体系中有目标菌株存在时，mips通过多重相互作用机制，实现对细菌的高效识别，合成的分子印迹材料不透明且厚度较大，荧光激发光的穿透力会受到限制，由于细菌的存在，激发光会被生物组织高度散射和吸收，使得那些被细菌覆盖的荧光分子无法被有效激发，进而产生了荧光淬灭的现象，通过荧光强度的变化来实现对目标菌株的检测。
30、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
31、(1)本发明将三维光子晶体微球作为载体，其具有比表面积大、表面易修饰、结构均一等优点，可提高检测效率，减少材料成本。
32、(2)本发明制备的分子印迹光子晶体微球芯片，通过创新的表面印迹技术，成功在三维光子晶体微球表面合成了待检测细菌的印迹层。这种设计不仅优化了模板洗脱过程，使模板细菌和聚合物外壳之间的键能够高效解离，而且在印迹层表面形成了独特的印迹空腔。这些空腔能够精确匹配并重新吸附模板菌株，使细菌与印迹空腔内的结合位点之间的相互作用更为高效。相较于传统的印迹方法，本发明的表面印迹技术展现出显著的优势，为细菌检测提供了一种更为精准、高效的手段。
33、(3)通过3-甲酰基苯硼酸和氨基硅烷化试剂反应生成功能单体，该功能单体具有广谱选择性，硼酸功能化材料能够选择性抓取含有顺式二轻基结构的生物分子，其操作简单，通过ph的切换实现对目标化合物进行抓取和释放。
34、(4)本发明利用制备的分子印迹光子晶体微球芯片来检测食源性致病菌，方法简便快速，成本低，能够一次并行对大量样品进行测定，当待检测的样品与芯片上的点样接触时，每个点样的信号强度可以反应特定样品中待测物的存在与否、数量和活性状态，实现高通量检测，有效缩短检测时间。对三种食源性致病菌的线性检测范围宽，为102-109cfu/ml，检测成本低，无需专业人员操作，克服了现有检测技术存在的缺点，满足快速即时检测实际样品中食源性致病菌的需求。
35、(5)本发明制备的分子印迹光子晶体微球芯片是以三维光子晶体微球作为捕获载体，微球表面的印迹层作为捕获菌株的工具，不需要大型仪器，利用晶芯微阵列芯片扫描仪检测即可，通过减少耗时的生长培养，解决复杂的样品处理问题，该发明可以显著加快样品检测的时间，从而使检测人员在30min内得出结果、可用于现场检测。
1.一种三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述模板菌为大肠杆菌o157:h7、沙门氏菌、志贺氏菌中的任意一种或者多种，模板菌液的浓度为106-109cfu/ml，所述溶液为磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中功能单体为硅烷化的3-甲酰基苯硼酸，基于苯硼酸的硼酸基团在碱性条件下可以和细菌表面的顺式二羟基化合物形成共价的五元或六元环状酯，作为功能基团可特异性识别细菌，添加功能单体的浓度为2-5μmol/ml。
4.根据权利要求1所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中荧光单体为硅烷化的异硫氰酸酯荧光素，添加浓度优选为70-90nmol/ml。
5.根据权利要求1所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中光子晶体微球通过微流控平台制备；所述交联剂为原硅酸四乙酯，添加浓度为30-120μmol/ml，通过光子晶体微球表面修饰的氨基引发聚合反应的发生，无需额外添加引发剂，利用光子晶体微球作为载体，采用表面印迹的方式，使印记层在微球表面聚合。
6.根据权利要求1所述的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中使用的洗脱液为醋酸-甲醇/水混合液，当环境变为酸性时，硼酸基团与细菌表面的顺式二羟基化合物形成的环状酯会发生离解，通过ph的切换实现对目标物的抓取和释放。
7.一种权利要求1所述的制备方法所制备的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片在高通量同时检测多种食源性致病菌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为将三维全细胞分子印迹光子晶体微球与待检测的目标菌株混合，反应结束后，用缓冲液冲洗三维全细胞分子印迹光子晶体微球2-3次，将得到的待检测的三维全细胞分子印迹光子晶体微球置于表面涂有pdms的载玻片上阵列式排布，组成芯片；采集捕获细菌后的三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片中每个微球的荧光强度，与空白组对照，对三维全细胞分子印迹光子晶体微球芯片中每个微球的荧光强度进行采集，然后计算捕获细菌前后的荧光强度的变化，实现对食源性致病菌的快速检测。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述高通量同时检测多种食源性致病菌是以荧光信号源为响应元件，分子印迹层为特异性识别元件，将分子印迹聚合物的高选择性与荧光检测的高灵敏度结合，弥补了分子印迹仅能识别但不能传输信号的缺陷；当反应体系中有目标菌株存在时，分子印迹聚合物通过多重相互作用机制，实现对细菌的高效识别，合成的分子印迹材料不透明且厚度较大，荧光激发光的穿透力会受到限制，由于细菌的存在，激发光会被生物组织高度散射和吸收，使得那些被细菌覆盖的荧光分子无法被有效激发，进而产生了荧光淬灭的现象，通过荧光强度的变化来实现对目标菌株的检测。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将pdms与固化剂混合，然后涂在与晶芯微阵列芯片扫描仪相匹配的载玻片上，固化后，将待检测的三维全细胞分子印迹光子晶体微球置于表面涂有pdms的载玻片上组成芯片，使用晶芯微阵列芯片扫描仪对芯片上捕获了细菌的微球进行荧光信号采集，一次并行对大量样品进行同时测定，实现高通量检测。
