本发明涉及半月板病变机制，尤其涉及一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法。
背景技术：
1、尿酸(uricacid，ua)是嘌呤核苷酸代谢的最终产物。人类尿酸有两部分来源，一部分来自氨基酸和核酸等细胞代谢产生，称为内源性尿酸；摄取食物分解代谢产生的尿酸称为外源性尿酸。由于人类缺少尿酸酶，故人类的血清尿酸(serumuricacid，sua)水平比其他含有尿酸酶的哺乳动物高。当摄入过多高嘌呤食物会导致ua生成和排泄的平衡被打破，sua水平升高，就会引起高尿酸血症的发生，已有研究发现痛风患者半月板上存在尿酸盐沉积，对半月板的结构和功能产生不利影响。
2、半月板是膝关节的内部结构，对健康的膝关节至关重要。半月板因受伤或退行性过程而受损，则关节炎等疾病的风险会急剧增加。半月板血管少，血液供应差，半月板组织细胞内存在一定程度的保护性自噬，因此半月板损伤常难自愈。半月板间充质干细胞是在半月板中发现的具有自我更新能力的干细胞。半月板间充质干细胞的细胞群落更小，增长更慢，更倾向于定向分化为软骨细胞。当半月板发生损伤后，mescs可通过趋化作用迁移至损伤部位，发挥半月板组织的修复功能。因此，mescs在半月板组织损伤修复和稳定性维护等方面具有重要的作用；
3、但是目前对于关于半月板的大多数研究都集中在损伤的外部因素和临床上治疗的改进，缺少对高尿酸和半月板损伤间的关系和机制的研究，因此需要以高尿酸为影响因素，从分子机制的层面上探索其对mescs的作用及其在半月板损伤过程中的作用，为半月板损伤的临床治疗和修复提供新思路。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，包括如下步骤：
4、s1：收集1051名半月板损伤患者和2027名健康体检者的空腹静脉血检测信息，比较半月板损伤的患者与健康体检者血清肾脏功能指标；
5、s2.1：从骨科膝部外科手术的患者半月板组织中分离提取mescs，然后使用流式细胞术的方法检测ua对mescs周期变化和凋亡情况的影响，检测其分化情况并验证ua对mescs分化潜能的影响，并生产用于染色的分化细胞；并使用多种染色剂对分化细胞进行染色检测尿酸对mescs成脂、成软骨和成骨分化能力的影响；
6、s2.2：mescs接种于孔板中加入不同浓度的ua，随后通过加入cck-8试剂检测ua对mescs的增殖能力的影响；
7、s2.3：使用qrt-pcr法检测炎性因子和基质金属蛋白酶和聚蛋白多糖酶(adamtss)基因的表达；通过qrt-pcr实验验证分化标志物基因表达情况，通过实时定量聚合酶链式反应检测ua对mescs促炎因子和金属基质蛋白酶目的基因的影响；
8、s3：对不同浓度ua处理后的mescs进行sa-β-gal染色、观察细胞颜色变化，验证ua对mescs衰老的影响；通过westernblot实验检测其衰老标记蛋白p16、p21表达的变化；
9、s4：建立sd大鼠高尿酸动物模型，对模型大鼠给予尿酸灌胃处理，随后提取半月板组织，用he染色和番红固绿染色观察半月板内部结构和胶原表达情况的变化；
10、s5：对不同浓度尿酸处理后的人源mescs进行转录组测序，验证尿酸通过何种分子机制影响mescs，并通过westernblot实验对关键信号通路进行蛋白表达的验证。
11、优选的：所述s2.1步骤中在生产分化细胞时先将细胞接种于6孔板，每孔接种6×104个细胞，置于细胞培养箱中；24-48h后，再将培养基更换为成软骨诱导培养基、成脂诱导培养基和成骨诱导培养基；在实验组中的分化培养基中加入尿酸(浓度为0.2mm和0.8mm)，对照组加入对应的分化培养基；每三天更换一次培养基培养21天生产分化细胞。
12、进一步的：所述染色剂使用油红o染色试剂检测分化后的脂肪细胞，番红o染色试剂检测分化后的软骨细胞，茜素红s染色液检测分化后的骨细胞。
13、进一步的：所述s2.2步骤中加入的ua浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8mm。
14、作为本发明一种优选的方案：所述加入cck-8试剂的时间为加ua处理后的24，48，72h，在细胞培养箱中避光孵育2h后，随后用微板仪测定450nm处的吸光度。
15、作为本发明进一步的方案：所述s3步骤中加入ua浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.8mm，其中0为对照组。
16、作为本发明再进一步的方案：所述ua处理mescs等待48h后再进行sa-β-gal染色。
17、在前述方案的基础上：所述s4步骤中对模型大鼠尿酸灌胃时间为六周。
18、在前述方案的基础上：所述在s2.2s步骤中进一步用annexin-v-apc/pi双重染色的流式细胞术进行分析，检测ua含量对mescs细胞数量维持的影响。
19、本发明的有益效果为：
20、1.一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，通过多次检测证明了尿酸会通过多种复杂的分子机制从多个生物学功能层面影响mescs的细胞干性，减少这些对半月板功能维稳和损伤修复起重要作用的干细胞数量，促进半月板组织的退行性病变，最终致使半月板更容易发生组织损伤，尿酸与半月板之间存在密切关联，血清高尿酸含量可能是导致半月板退行性改变的潜在诱因之一，为半月板损伤的早期预防及其临床治疗提供宝贵的线索与重要信息。
21、2.一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，通过比较半月板损伤的患者和健康体检者，半月板损伤的患者血清尿酸值、血尿素氮和肌酸酐值明显高于健康体检者中的相应值，具有区别有统计学差异，说明高尿酸与半月板之间存在一定的临床相关性。
22、3.一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，通过细胞分化染色实验证明尿酸对mescs不同分化方向有着不同的影响，其促进mescs成骨和成脂的非定向分化，而对mescs成软骨的定向分化起抑制作用。
23、4.一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，通过sa-β-gal染色和westernblot实验证明尿酸呈剂量依赖性诱导mescs的衰老。
24、5.一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，通过大鼠高尿酸动物模型证明尿酸显著影响了sd大鼠半月板的组织形态，明显促发了半月板的病理损伤。
1.一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述s2.1步骤中在生产分化细胞时先将细胞接种于6孔板，每孔接种6×104个细胞，置于细胞培养箱中；24-48h后，再将培养基更换为成软骨诱导培养基、成脂诱导培养基和成骨诱导培养基；在实验组中的分化培养基中加入尿酸(浓度为0.2mm和0.8mm)，对照组加入对应的分化培养基；每三天更换一次培养基培养21天生产分化细胞。
3.根据权利要求2所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述染色剂使用油红o染色试剂检测分化后的脂肪细胞，番红o染色试剂检测分化后的软骨细胞，茜素红s染色液检测分化后的骨细胞。
4.根据权利要求1所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述s2.2步骤中加入的ua浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.8mm。
5.根据权利要求4所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述加入cck-8试剂的时间为加ua处理后的24，48，72h，在细胞培养箱中避光孵育2h后，随后用微板仪测定450nm处的吸光度。
6.根据权利要求1所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述s3步骤中加入ua浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.8mm，其中0为对照组。
7.根据权利要求6所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述ua处理mescs等待48h后再进行sa-β-gal染色。
8.根据权利要求1所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述s4步骤中对模型大鼠尿酸灌胃时间为六周。
9.根据权利要求4所述的一种研究尿酸诱导半月板病变机制的试验方法，其特征在于，所述在s2.2s步骤中进一步用annexin-v-apc/pi双重染色的流式细胞术进行分析，检测ua含量对mescs细胞数量维持的影响。
