本发明涉及生物，尤其涉及富甜菜碱酵母提取物的制备方法。
背景技术：
1、甜菜碱是一种生物碱，极易溶于水，普遍存在于动植物体内，是动物代谢的中间产物，在营养物质的代谢中起着十分重要的作用，同时也是非常重要的渗透调节物质。天然来源的甜菜碱在食品行业应用广泛，摄入的甜菜碱特定建议值(spl)为1.5g/天，主要能够提供活性甲基，降低血清同型半胱氨酸水平；节约蛋氨酸，促进蛋白质合成；促进脂质代谢，抑制肝脏脂质沉积；调节细胞渗透压，减轻环境应激反应。
2、甜菜碱的制备目前主要包括提取法和合成法两种，其中：提取法主要依赖于从甜菜制糖母液中回收甜菜碱，其优点在于原料来源相对丰富，且提取过程无需复杂的化学反应，对环境的污染较小。然而，这种方法的提取效率受母液中甜菜碱含量的影响较大，且提取过程中可能会引入其他杂质，导致产品纯度不高。合成法则通过化学反应直接制备甜菜碱，其优点在于产品纯度高，产率高，且不受原料中甜菜碱含量的限制。但合成法需要使用化学试剂，可能对环境造成一定的污染，且操作过程需要严格控制反应条件，以确保产品的质量和安全。
3、可见，不论是提取法还是合成法制备甜菜碱都存在一定的弊端。酵母提取物是以食用酵母为原料，经酶解精制将酵母细胞内的蛋白质、核酸降解释放得到的天然制品，富含多肽、氨基酸、核苷酸，提供丰富的营养物质，作为一种食品配料，纯天然、丰富的营养成分使其在食品加工业得到广泛应用，甜菜碱酵母提取物形成协同作用有更好的生理作用，但目前没有尚未见甜菜碱酵母提取物的报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供富甜菜碱酵母提取物的制备方法。
2、本发明提供了富甜菜碱酵母提取物的制备方法，包括：将酵母菌进行发酵培养后，经酶解获得提取物。
3、本发明通过酵母在生长过程中对富含甜菜碱碳源中的甜菜碱进行吸收富集获得富含甜菜碱的酵母，然后通过酶解精制得到富甜菜碱酵母提取物；富含甜菜碱的酵母提取物包括蛋白质、氨基酸、肽类、核苷酸、甜菜碱，蛋白质质量百分含量为50%~75%，甜菜碱质量百分含量为0.2%~4%。
4、本发明中，所述制备方法中的酵母菌为对甜菜碱具有良好富集和吸收能力的酵母，实施例中，所述的酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、布拉迪酵母、假丝酵母、扣囊覆膜酵母中的至少一种。相对于其他种类的酵母，如前所述的酵母能够富集获得更高含量的甜菜碱。例如，本发明中所述的酵母为酿酒酵母、毕赤酵母、布拉迪酵母、假丝酵母、扣囊覆膜酵母中的任意一种，也可以为如前所述酵母中至少两种的复合菌，例如，所述酵母为酿酒酵母和毕赤酵母，或为酿酒酵母和布拉迪酵母，或为酿酒酵母和假丝酵母，或为酿酒酵母和扣囊覆膜酵母，或为毕赤酵母和布拉迪酵母，或为毕赤酵母和布拉迪酵母，或为毕赤酵母和扣囊覆膜酵母，或为布拉迪酵母和假丝酵母，或为布拉迪酵母和扣囊覆膜酵母，或为酿酒酵母、毕赤酵母和布拉迪酵母、或为酿酒酵母、毕赤酵母和假丝酵母、或为酿酒酵母、毕赤酵母和扣囊覆膜酵母、或为酿酒酵母、布拉迪酵母和扣囊覆膜酵母、或为酿酒酵母、假丝酵母和扣囊覆膜酵母、或为毕赤酵母、布拉迪酵母和假丝酵母、或为毕赤酵母、布拉迪酵母和扣囊覆膜酵母、或为布拉迪酵母、假丝酵母和扣囊覆膜酵母。
5、具体实施例中，所述酿酒酵母为酿酒酵母菌株fx-2（保藏编号为cctcc no：m2016418），所述毕赤酵母为毕赤酵母c1.8（保藏编号为cctcc no:m2017780），所述布拉迪酵母为布拉迪酵母安琪1.27（保藏编号为cctcc no:m2012116），所述假丝酵母为假丝酵母c1.7（保藏编号为cctcc no:m2017782），所述扣囊复膜酵母菌d6.16（保藏编号为cctcc no:m2019570）。
6、本发明在酵母生长发酵过程中加入富含甜菜碱（2%~8%）的碳源、加入kcl和nacl、n源和p源提前流加完使酵母充分吸收富集甜菜碱得到富甜菜碱的酵母后，采用酶解工艺使酵母破壁释放胞内物质。
7、本发明中，所述发酵培养的培养液包括：甜菜糖蜜、氨水、nacl、kcl、nh4h2po4、硫酸铜、生物素、vb1和vb2。
8、其中，所述甜菜糖蜜是甜菜制糖工业中的一种副产品，是甜菜在加工成糖的过程中，经过压榨和提取糖分后剩余的浓稠液体。其中甜菜碱的含量为2%~8%。具体的，所述甜菜糖蜜中以还原糖计，甜菜碱折干计含量为2%~8%。
9、其中，所述硫酸铜还可以为硫酸铜的水合物，例如：五水硫酸铜（cuso4·5h2o）和/或一水硫酸铜（cuso4·h2o）。所述氨水为质量分数为20%的氨水，以n的含量计算。
10、培养液对制备后提取物中的活性成分产生重要影响。本发明所述的培养液中，营养物质设置合理，更有利于甜菜碱的富集。相对于不含有钾离子、钠离子或者配比、浓度不恰当的培养液，本发明的培养液用于酵母的培养，获得的酵母提取物中甜菜碱的含量更高。
11、一些实施例中，所述培养液包括水和甜菜糖蜜80~200 g/l、20%氨水5~30 ml/l，nacl 2~20 g/l，kcl 2~20 g/l、nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.001~0.05g/l、生物素0.001~0.05 g/l，vb1 0.002~0.2g/l和vb2 0.001~0.1g/l。
12、更具体的，所述培养液由水和如下组分组成：甜菜糖蜜（还原糖计，甜菜碱含量折干计4%）150g/l，质量浓度为20%氨水30ml/l，nacl 6g/l，kcl 2g/l，nh4h2po4 3g/l，五水硫酸铜0.005g/l，生物素 0.02g/l，vb1 0.01g/l，vb2 0.002g/l。
13、本发明在发酵后，通过酶解的方式使甜菜碱更好的溶出，本发明中，所述酶解的酶包括蛋白酶、甘露聚糖酶和/或β-葡聚糖酶中的至少一种。例如，所述酶解采用蛋白酶，或采用甘露聚糖酶，或采用β-葡聚糖酶，或采用蛋白酶和甘露聚糖酶，或采用蛋白酶和β-葡聚糖酶，或采用甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶，或采用蛋白酶、甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶。
14、一些实施例中，所述酶解步骤中，酶的质量为酵母质量的0.1%~1%，酶解的条件包括40~70℃，ph至5~7，酶解5~20h。
15、一些具体实施例中，所述酶解为蛋白酶酶解，酶的质量为酵母质量的0.1%~1%，酶解的条件包括40~60℃，ph至5~6，酶解15~20h；作为优选，蛋白酶酶解的条件包括，酶的质量为酵母质量的0.5%，酶解的条件包括50℃，ph至5.5，酶解18h。
16、一些具体实施例中，所述酶解为甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶酶解，其中，甘露聚糖酶与β-葡聚糖酶的质量比为1：1，酶的质量为酵母质量的0.1%~1%，酶解的条件包括50~70℃，ph至4.5~5.0，酶解10~20h。作为优选，酶的质量为酵母质量的0.2%，酶解的条件包括60℃，ph至5.0，酶解15h。
17、本发明对发酵的条件进行了优化和改良，优化后的条件所述发酵的条件包括：所述发酵的条件包括：发酵初始培养液中不含有甜菜糖蜜、氨水或nh4h2po4，发酵过程中流加甜菜糖蜜、氨水和nh4h2po4。
18、一些实施例中，发酵初始，培养液的组成为水和nacl 2~20 g/l，kcl 2~20 g/l、五水硫酸铜0.001~0.05g/l、生物素 0.001~0.05 g/l，vb1 0.002~0.2g/l和vb2 0.001~0.1g/l。每升培养液共流加入甜菜糖蜜80~200 g/l、20%氨水5~30 ml/l，nh4h2po4 1~5 g/l。
19、更具体的，发酵过程中，调节甜菜糖蜜的流加速度以使发酵体系中乙醇的质量分数不高于0.3%；调节nh4h2po4的流加速度以使酵母中p2o5质量分数为1%~5%；通过调节氨水流加速度以使酵母中蛋白质的质量分数为30%~60%。
20、在一些具体实施例中，nh4h2po4在发酵第400~500 min流加完，氨水在500~720 min流加完。
21、所述发酵的条件还包括：转速200~700rpm，无菌空气风量为0.5~4l空气/（l发酵液×min），发酵温度28~35 ℃，发酵时间10~20 h。作为优选，转速200~600rpm，无菌空气风量为1~3l空气/（l发酵液×min），发酵温度30 ℃，发酵时间15 h。
22、本发明中，所述发酵的步骤中，接种后培养液中酵母浓度为50g/l。
23、本发明实施例中，所述发酵前还包括摇瓶种子培养和种子发酵的步骤；
24、所述摇瓶种子培养的培养基包括水、80~120 /lg葡萄糖、10~30 g/l酵母抽提物、0.8~1.2 g/l kh2po4和0.8~1.2 g/l mgso4；作为优选，摇瓶种子培养基由水和如下浓度的组分：100g/l 葡萄糖、20g/l 酵母抽提物、1g/l nh4h2po4、1g/l mgso4。
25、所述种子发酵的培养基包括水、甜菜糖蜜50~150 g/l，硫酸镁0.5~2.0 g/l，硫酸铵10~30 g/l，nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.004~0.02 g/l、生物素 0.001~0.5 g/l，vb10.002~0.2g/l，vb2 0.001~0.1g/l。作为优选，所述种子发酵的培养基由水和如下浓度的组分组成：甜菜糖蜜（还原糖计，甜菜碱含量折干计6%）100g/l，硫酸镁1.0g/l，硫酸铵30g/l，nh4h2po4 3g/l、五水硫酸铜0.005g/l、生物素 0.02g/l，vb1 0.01g/l，vb2 0.002g/l。
26、本发明中，所述发酵后和酶解前，还包括高压均质破壁的步骤，所述高压均质破壁的条件包括：将发酵产物经洗涤后，制成质量分数为10%~15%的悬浮液，高压均质的压力1000~1500 bar，进料速度 5~10 l/h。作为优选，均质包括：将发酵产物经洗涤后，制成质量分数为10%的悬浮液，高压均质的压力1300 bar，进料速度 8 l/h。
27、本发明中，所述制备方法中所述酶解之后还包括灭酶、膜分离和/或干燥的步骤，
28、所述灭酶的条件包括80~100℃处理0.5~2h；作为优选，灭酶的条件为90℃处理1h。
29、所述膜分离的截留分子量为20~500kda；作为优选，截留分子量为500kda。
30、一些具体实施例中，所述制备方法包括：
31、所述酵母菌，经摇瓶种子培养、种子发酵后进行商品发酵，然后用蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶酶解中至少一种进行酶解，获得所述提取物；
32、其中，酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母、布拉迪酵母、假丝酵母、扣囊覆膜酵母中的至少一种；
33、所述摇瓶种子培养的培养基包括水、80~120 /lg葡萄糖、10~30 g/l酵母抽提物、0.8~1.2 g/l kh2po4和0.8~1.2 g/l mgso4；
34、所述种子发酵的培养基包括水、甜菜糖蜜50~150 g/l，硫酸镁0.5~2.0 g/l，硫酸铵10~30 g/l，nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.004~0.02 g/l、生物素 0.001~0.5 g/l，vb10.002~0.2g/l，vb2 0.001~0.1g/l；
35、所述商品发酵的培养液包括水和甜菜糖蜜80~200 g/l、20%氨水5~30 ml/l，nacl2~20 g/l，kcl 2~20 g/l、nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.001~0.05g/l、生物素 0.001~0.05 g/l，vb1 0.002~0.2g/l和vb2 0.001~0.1g/l。
36、或者，一些具体实施例中，所述制备方法包括：
37、所述酵母菌，经摇瓶种子培养、种子发酵后进行商品发酵，1300bar，进料流速8l/h进行高压均质破壁后，用蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶酶解中至少一种进行酶解，然后经过500kda分子量截留分离后，分离上清液获得所述提取物；
38、其中，酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母、布拉迪酵母、假丝酵母、扣囊覆膜酵母中的至少一种；
39、所述摇瓶种子培养的培养基包括水、80~120 /lg葡萄糖、10~30 g/l酵母抽提物、0.8~1.2 g/l kh2po4和0.8~1.2 g/l mgso4；
40、所述种子发酵的培养基包括水、甜菜糖蜜50~150 g/l，硫酸镁0.5~2.0 g/l，硫酸铵10~30 g/l，nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.004~0.02 g/l、生物素 0.001~0.5 g/l，vb10.002~0.2g/l，vb2 0.001~0.1g/l；
41、所述商品发酵的培养液包括水和甜菜糖蜜80~200 g/l、20%氨水5~30 ml/l，nacl2~20 g/l，kcl 2~20 g/l、nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.001~0.05g/l、生物素 0.001~0.05 g/l，vb1 0.002~0.2g/l和vb2 0.001~0.1g/l。
42、进一步的，本发明还提供了如前所述制备方法制备获得的富甜菜碱酵母提取物。
43、本发明中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为50%~75%，甜菜碱的质量百分含量为0.2%~4%。一些实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为55.39%~73.21%，甜菜碱的质量百分含量为0.3%~4%。一些具体实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为68.64%，甜菜碱的质量百分含量为2%。一些具体实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为70.42%，甜菜碱的质量百分含量为3%。一些具体实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为73.21%，甜菜碱的质量百分含量为4%。一些具体实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为55.39%，甜菜碱的质量百分含量为1.0%。一些具体实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为68.49%，甜菜碱的质量百分含量为0.6%。一些具体实施例中，所述富甜菜碱酵母提取物中蛋白质的质量百分含量为69.93%，甜菜碱的质量百分含量为0.3%。
44、更进一步的，本发明还提供了含有如前所述富甜菜碱酵母提取物的产品，所述产品为食品、保健食品、饲料或药物。
45、本发明提供一种富甜菜碱酵母提取物的制备方法，其中，富含甜菜碱的酵母提取物包括蛋白质、氨基酸、肽类、核苷酸、甜菜碱，蛋白质质量百分含量为50%-75%，甜菜碱质量百分含量为0.2%-4%，本发明通过酵母在生长过程中对富含甜菜碱碳源中的甜菜碱进行吸收富集获得富含甜菜碱的酵母，然后通过酶解精制得到富甜菜碱酵母提取物，这一技术弥补了甜菜碱酵母提取物的空白，主要涉及食品、保健食品、饲料、医药等领域。
1.富甜菜碱酵母提取物的制备方法，包括：将酵母菌进行发酵培养后，经酶解获得提取物；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养液包括水和甜菜糖蜜80~200g/l、20%氨水5~30 ml/l，nacl 2~20 g/l，kcl 2~20 g/l、nh4h2po4 1~5 g/l、五水硫酸铜0.001~0.05g/l、生物素 0.001~0.05 g/l，vb1 0.002~0.2g/l和vb2 0.001~0.1g/l。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件包括：发酵初始，培养液的组成为水和nacl 2~20 g/l，kcl 2~20 g/l、五水硫酸铜0.001~0.05g/l、生物素 0.001~0.05 g/l，vb1 0.002~0.2g/l和vb2 0.001~0.1g/l，发酵过程中流加甜菜糖蜜、氨水和nh4h2po4；
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件还包括：转速200~700rpm，无菌空气风量为0.5~4l空气/（l发酵液×min），发酵温度28~35 ℃，发酵时间10~20 h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
6.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵前还包括摇瓶种子培养和种子发酵的步骤；
7.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵后和酶解前，还包括高压均质破壁的步骤，所述高压均质破壁的条件包括：将发酵产物经洗涤后，制成质量分数为10%~15%的悬浮液，高压均质的压力1000~1500 bar，进料速度 5~10 l/h。
8.根据权利要求1~5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶解之后还包括灭酶、膜分离和/或干燥的步骤，
9.权利要求1~8任一项制备获得的富甜菜碱酵母提取物。
10.根据权利要求9所述的富甜菜碱酵母提取物，其特征在于，其中蛋白质的质量百分含量为50%~75%，甜菜碱的质量百分含量为0.2%~4%。
11.含有权利要求9或10所述富甜菜碱酵母提取物的产品，所述产品为食品、保健食品、饲料或药物。
