本发明涉及一种衰老细胞系、衰老皮肤模型的构建方法及应用，属于细胞生物学、分子生物学。
背景技术：
1、皮肤衰老是人体衰老的一种表现，主要表现为皮肤可见晦暗、干燥、色斑、细纹、松弛等。衰老细胞(senescent cells)是一个从细胞层面来描述机体老化的过程。衰老细胞是细胞中一种特殊的存在，在健康的细胞遭受到分子或者细胞层面的压力，比如dna损伤，氧化自由基，化学伤害，辐射伤害或者物理损伤的时候，会启动这个衰老机制让这些细胞转化成衰老细胞从而阻止它们继续增殖。衰老细胞没有健康细胞全部的功能，也不会继续生长和分裂，如僵尸一般存在于身体组织中，也因此被戏称为“僵尸细胞”。
2、现有的衰老皮肤模型/人类皮肤等效物通常是使用年老患者来源的细胞，或者使用物理或方法诱导的衰老细胞建立的。现有技术的衰老皮肤模型/人类皮肤等效物的方法存在以下弊端：1、原代细胞来源有限，细胞比较珍贵，不适合批量建立；2、衰老细胞的增殖和分化能力较年轻细胞较低，因此全部用这种细胞建立3d皮肤模型在技术上不完全可行，有研究证实现有技术的衰老成纤维细胞占所有成纤维细胞30％以上时便无法建立。
技术实现思路
1、本发明提供了衰老细胞系，解决原代细胞来源有限、传代增殖能力有限的问题；本发明提供的衰老皮肤模型可以应用于抗衰领域的药物筛选和表皮衰老的机制研究。
2、为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
3、本发明的第一个方面，提供了一种衰老细胞系的构建方法，包括以下步骤：
4、s1、在原细胞中转染含目的基因sv40-t的重组质粒；
5、s2、在转染后的原细胞培养体系中加入四环素；
6、s3、培养一定时间后获得衰老细胞系。
7、本发明使用sv40-t建立永生化细胞系，然后采用四环素(强力霉素doxycycline)关闭这个sv40-t基因，最终成功构建了衰老细胞系。
8、优选的，所述原细胞为人类角质形成细胞或成纤维细胞。
9、优选的，所述四环素为强力霉素，所述强力霉素的浓度为4-6μg/ml，强力霉素连续添加4天以上的时间。
10、优选的，所述含目的基因sv40-t的重组质粒为plvx-tetoff-sv40-t-bsd。
11、在本发明中，plvx-tetoff-sv40-t-bsd，质粒构建包含sv40-t抗原的编码区，该区域下游链接了一个反应于四环素调控剂的启动子，从而实现对sv40-t抗原表达的控制。启动子设计为在四环素或类四环素药物存在时抑制基因表达，从而实现对目标蛋白表达的精确调控；同时包含一个blasticidin s抗性基因，从而在实验室的选择条件下稳定存在，便于进行长期的细胞培养和基因表达实验。
12、优选的，使用慢病毒在角质形成细胞中转染含有目的基因sv40-t的重组质粒，方法如下：
13、a)在10cm细胞培养皿中用含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中培养hek293t细胞。按照4：3：1的质量比例以20μg的总质量在500μl无血清培养基(opti-mem)中添加目的基因质粒(plvx-tetoff-sv40-t-bsd)和慢病毒外壳质粒pmd2-vsvg、ppax2。在另一份opti-mem中，以慢病毒质量：聚乙烯亚胺(pei)体积比例为1:3制备pei溶液，并将其添加至前一份质粒溶液中，吹打均匀静置15分钟。随后将混合溶液加入到融合度达到90％的hek293t细胞中。经过16小时培养后，将培养基更换为常规完整培养基；在培养48小时和72小时后收集含有慢病毒的上清液，并通过0.45微米的滤器进行过滤；
14、b)将处于对数生长期的表皮角质形成细胞(nheks细胞)种植在6孔培养板上，当细胞融合度达到50％-60％时，在1ml的培养基中加入50μl慢病毒和100μg/ml的聚凝胺(polybrene)，感染过的nheks细胞在过夜孵化后，换成正常培养基进行培养；
15、c)从第二天开始，我们在培养基中加入20μg/ml的杀稻瘟菌素s，连续培养4天，使用4μg/ml的强力霉素(doxycycline，dox)来激活tet-off启动子从而停止sv40-t的表达，通常连续添加4天及以上时间。
16、本发明的第二个方面，提供了本发明所述的衰老细胞系的构建方法构建的衰老细胞系。
17、优选的，一种衰老细胞系的构建方法，包括以下步骤：
18、s1、在原细胞中转染含目的基因sv40-t的重组质粒；
19、s2、在转染后的原细胞培养体系中加入四环素；
20、s3、培养一定时间后获得衰老细胞系。
21、优选的，所述原细胞为人类角质形成细胞或成纤维细胞。
22、优选的，所述四环素为强力霉素，所述强力霉素的浓度为4-6μg/ml，强力霉素连续添加4天以上的时间。
23、优选的，所述含目的基因sv40-t的重组质粒为plvx-tetoff-sv40-t-bsd。
24、本发明的第三个方面，提供了一种衰老皮肤模型的构建方法，包括以下步骤：
25、r1、将原代成纤维细胞和胶原蛋白混合，滴加在transwell小室膜上凝结，培养平衡过夜；
26、r2、将实施例1-5任意一项所述的衰老细胞系接种在步骤r1的成纤维细胞基质层上，培养至单层汇合；
27、r3、transwell小室内的培养基吸干，transwell小室外的培养基添加至正好触及膜，使细胞位于气-液交界面，促使其向上分化，使用的培养基额外添加l-抗坏血酸、氯化钙和人转铁蛋白；
28、r4、培养的第7天时在培养基中添加四环素；
29、r5、培养10-14天可以形成衰老皮肤模型。
30、优选的，培养基为epilife培养基。
31、优选的，所述四环素为强力霉素，所述强力霉素的浓度为4-6μg/ml。
32、优选的，
33、本发明的第四个方面，提供了本发明所述的衰老皮肤模型的构建方法构建的衰老皮肤模型。
34、优选的，一种衰老皮肤模型的构建方法，包括以下步骤：
35、r1、将原代成纤维细胞和胶原蛋白混合，滴加在transwell小室膜上凝结，培养平衡过夜；
36、r2、将实施例1-5任意一项所述的衰老细胞系接种在步骤r1的成纤维细胞基质层上，培养至单层汇合；
37、r3、transwell小室内的培养基吸干，transwell小室外的培养基添加至正好触及膜，使细胞位于气-液交界面，促使其向上分化，使用的培养基额外添加l-抗坏血酸、氯化钙和人转铁蛋白；
38、r4、培养的第7天时在培养基中添加四环素；
39、r5、培养10-14天可以形成衰老皮肤模型。
40、优选的，培养基为epilife培养基。
41、优选的，所述四环素为强力霉素，所述强力霉素的浓度为4-6μg/ml。
42、优选的，50μg/ml l-抗坏血酸、1.15mm氯化钙和10μg/ml人转铁蛋白。
43、本发明的第五个方面，提供了本发明所述的衰老细胞系，和/或，本发明所述的衰老皮肤模型在制备抗税老药物模型、衰老机制研究模型中的应用。
44、与现有技术相比，应用本发明的技术方案的有益效果及显著进步在于：
45、1、本发明构建的衰老细胞系、衰老皮肤模型的方法新颖，先建立永生化细胞系，然后关闭sv40-t基因，最终成功构建了衰老细胞系和衰老皮肤模型；
46、2、本发明的方法可以解决细胞数量和传代增殖能力有限的问题，可以大量获得衰老细胞；
47、3、本发明构建的衰老细胞系、衰老皮肤模型可以应用于抗衰领域的药物筛选和表皮衰老的机制研究。
1.一种衰老细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种衰老细胞系的构建方法，其特征在于，所述原细胞为人类角质形成细胞或成纤维细胞。
3.如权利要求1所述的一种衰老细胞系的构建方法，其特征在于，所述四环素为强力霉素，所述强力霉素的浓度为4-6μg/ml，强力霉素连续添加4天以上的时间。
4.如权利要求1所述的一种衰老细胞系的构建方法，其特征在于，所述含目的基因sv40-t的重组质粒为plvx-tetoff-sv40-t-bsd。
5.权利要求1-4任意一项所述的衰老细胞系的构建方法构建的衰老细胞系。
6.一种衰老皮肤模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的衰老皮肤模型的构建方法，其特征在于，培养基为epilife培养基。
8.如权利要求6所述的衰老皮肤模型的构建方法，其特征在于，所述四环素为强力霉素，所述强力霉素的浓度为4-6μg/ml。
9.权利要求6-8任意一项所述的衰老皮肤模型的构建方法构建的衰老皮肤模型。
10.权利要求1-5任意一项所述的衰老细胞系，和/或，权利要求6-8任意一项所述的衰老皮肤模型在制备抗税老药物模型、衰老机制研究模型中的应用。
