本发明涉及病原菌分子鉴定，尤其涉及一种基于lamp技术的福氏志贺菌血清型鉴定用引物组合物及其在快速检测福氏志贺菌全部19个血清型中的应用。
背景技术：
1、志贺菌是人类细菌性痢疾的病原菌，其发病率和死亡率居感染性腹泻之首。据估计，全球范围内约89.6%的志贺菌感染是由福氏志贺菌和宋内志贺菌造成的（wang xy, taof, xiao d, lee h, deen j, gong j, zhao y, zhou w, li w, shen b et al: trendand disease burden of bacillary dysentery in china (1991-2000). bulletin ofthe world health organization 2006, 84(7):561-568.）。福氏志贺菌和宋内志贺菌是我国流行志贺菌的主要型别。根据1991-2000年的统计数据显示，我国主要流行的志贺菌是福氏志贺菌，占比为86%，其中优势血清型为2a，占福氏分离株的80%；宋内志贺菌占12%（yec, lan r, xia s, zhang j, sun q, zhang s, jing h, wang l, li z, zhou z et al:emergence of a new multidrug-resistant serotype x variant in an epidemicclone of shigella flexneri. journal of clinical microbiology 2010, 48(2):419-426.）。在一个基于全国哨点医院的2003年至2013年监测数据显示，在分离的2912株志贺菌中，福氏志贺菌为1610株，宋内志贺菌为1284株（qiu s, xu x, yang c, wang j, liangb, li p, li h, yi s, liu h, cui x et al: shift in serotype distribution ofshigella species in china, 2003-2013. clinical microbiology and infection :the official publication of the european society of clinical microbiology andinfectious diseases 2015, 21(3):252 e255-268.）。在山西省2006-2016年间分离的474志贺菌中，337株为福氏志贺菌(71%)，137株为宋内志贺菌(29%) ；分离的福氏志贺菌共有6个血清型，包括1a，1b，2a，2b，xv和5b。其中xv和1a是优势血清型分别占比43%和30%（wangy, ma q, hao r, et al. antimicrobial resistance and genetic characterizationof shigella spp. in shanxi province, china, during 2006-2016 [j]. bmcmicrobiology, 2019, 19(1): 116.）。
2、传统的福氏志贺菌血清型鉴定方法主要采用商业化的诊断抗血清与菌株进行玻片凝集反应，根据免疫凝集结果进行判定。商业化血清价格昂贵，某些新的血清型需要单克隆抗体进行辅助鉴定（如xv血清型需要群特异性抗血清7、8和单克隆抗体masf ⅳ-1结合判断），基层疾控部门不易获得，限制了其应用。而且血清凝集反应结果受到细菌培养条件和生长状态的影响，结果判定主观因素影响大，操作耗时耗力，也达不到快速、准确、特异的要求。
3、现有技术根据福氏志贺菌血清型相关基因建立了普通pcr和荧光定量pcr方法用于福氏志贺菌和宋内志贺菌的区分和血清型鉴定。福氏志贺菌血清型的多样性是由型特异性抗原决定簇（如i-v和ic）和群特异性抗原决定簇（如3，4；6；和7，8）决定的。根据福氏志贺菌xv血清型o抗修饰及其产生机制，分别针对型和群特异性抗原决定簇设计特异性引物，设计多重pcr体系可以用来检测血清型（sun, q.; lan, r.; wang, y.; zhao, a.; zhang,s.; wang, j.; wang, y.; xia, s.; jin, d.; cui, z. development of a multiplexpcr assay targeting o-antigen modification genes for molecular serotyping ofshigella flexneri. journal of clinical microbiology 2011, 49, 3766-3770.）。除了多重pcr方法外，根据福氏志贺菌血清型型特异性抗原决定簇和群特异性抗原决定簇基因也设计了荧光定量pcr方法（gentle, a.; ashton, p.m.; dallman, t.j.; jenkins,c. evaluation of molecular methods for serotyping shigella flexneri. journalof clinical microbiology 2016, 54, jcm.03386-03315.），并有商品化的试剂。但是这些方法对于反应试剂的要求较高，pcr反应需要2个小时左右的时间，结果判读需要进行凝胶电泳；荧光定量pcr体系需要多个多重反应同时进行才能进行血清型的检测，结果判读复杂，试剂价格较高，方法需要荧光定量pcr等大型仪器，不利于基层推广和使用。
4、此外，还有基于基因组的福氏志贺菌血清型鉴定方法，通过分析福氏志贺菌的基因组序列，获得福氏志贺菌基因组序列中决定血清型相关基因的基因序列，可以获得对应的福氏志贺菌血清型（gentle, a.; ashton, p.m.; dallman, t.j.; jenkins, c.evaluation of molecular methods for serotyping shigella flexneri. journal ofclinical microbiology 2016, 54, jcm.03386-03315.）。全基因组序列分析可以准确分析福氏志贺菌的血清型决定基因，但是全基因组序列分析需要生物信息学分析能力，这限制了其在基层实验室的应用。另外，基层实验室通常难以对所有菌株进行全基因组序列分析，全基因组序列分析的时限较长。
5、有鉴于此，提出本发明。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于lamp技术的福氏志贺菌血清型鉴定用引物组合物及其在快速检测福氏志贺菌全部19个血清型中的应用。
2、具体的，本发明的技术方案如下：
3、第一方面，本发明提供了用于检测福氏志贺菌血清型的lamp引物组，包括用于检测福氏志贺菌 gtrⅰ、 gtrⅰc、 oac、 gtrⅳ、 gtrⅴ和 oacc基因的lamp引物，
4、用于检测福氏志贺菌 gtrⅰ基因的lamp引物包括 gtrⅰ-f3、 gtrⅰ-b3、 gtrⅰ-fip和 gtr ⅰ-bip，核苷酸序列依次如seq id no.01~04所示；
5、用于检测福氏志贺菌 gtrⅰc基因的lamp引物包括 gtrⅰc-f3、gtri-b3、 gtrⅰc-fip和 gtrⅰc-bip，其核苷酸序列依次如seq id no.07~10所示；
6、用于检测福氏志贺菌 oac基因的lamp引物包括 oac-f3、 oac-b3、 oac-fip和 oac-bip，其核苷酸序列依次如seq id no.18~21所示；
7、用于检测福氏志贺菌 gtrⅳ基因的lamp引物包括 gtrⅳ-f3、 gtrⅳ-b3、 gtrⅳ-fip和 gtrⅳ-bip，其核苷酸序列依次如seq id no.24~27所示；
8、用于检测福氏志贺菌 gtrⅴ基因的lamp引物包括 gtrⅴ-f3、 gtrⅴ-b3、 gtrⅴ-fip和 gtrⅴ-bip，其核苷酸序列依次如seq id no.29~32所示；
9、用于检测福氏志贺菌 oacc基因的lamp引物包括 oacc-f3、 oacc-b3、 oacc-fip和 oacc-bip，其核苷酸序列依次如seq id no.45~48所示。
10、优选地，用于检测福氏志贺菌 gtrⅰ基因的lamp引物还包括：环引物 gtrⅰ-lf和 gtr ⅰ-lb，其核苷酸序列依次如seq id no.5~6所示；
11、和/或，用于检测福氏志贺菌 gtrⅰc基因的lamp引物还包括：环引物 gtrⅰc-lf，其核苷酸序列如seq id no.11所示；
12、和/或，用于检测福氏志贺菌 oac基因的lamp引物还包括：环引物 oac-lf和环引物 oac-lb，其核苷酸序列依次如seq id no.22~23所示；
13、和/或，用于检测福氏志贺菌 gtrⅳ基因的lamp引物还包括：环引物 gtrⅳ-lf，其核苷酸序列如seq id no.28所示；
14、和/或，用于检测福氏志贺菌 gtrⅴ基因的lamp引物还包括： gtrⅴ-lf和 gtrⅴ-lb，其核苷酸序列依次如seq id no.33~34所示；
15、和/或，用于检测福氏志贺菌 oacc基因的lamp引物还包括： oacc-lf，其核苷酸序列如seq id no.49所示。
16、优选地，所述lamp引物组还包括用于检测福氏志贺菌 gtrii、 gtrx和 opt基因的lamp引物，
17、用于检测福氏志贺菌 gtrii基因的lamp引物包括 gtrii-f3、 gtrii-b3、 gtrii-fip和 gtrii-bip，核苷酸序列依次如seq id no.12~15所示；
18、用于检测福氏志贺菌 gtrx基因的lamp引物包括 gtrx-f3、 gtrx-b3、 gtrx-fip和 gtrx-bip，核苷酸序列依次如seq id no.35~38所示；
19、用于检测福氏志贺菌 opt基因的lamp引物包括 opt-f3、 opt-b3、 opt-fip和 opt-bip，核苷酸序列依次如seq id no.40~43所示。
20、优选地，用于检测福氏志贺菌 gtrii基因的lamp引物还包括：环引物 gtrii-lf和 gtrii-lb，其核苷酸序列依次如seq id no.16~17所示；
21、和/或，用于检测福氏志贺菌 gtrx基因的lamp引物还包括：环引物 gtrx-lf，其核苷酸序列如seq id no.39所示；
22、和/或，用于检测福氏志贺菌 opt基因的lamp引物还包括：环引物 opt-lb，其核苷酸序列如seq id no.44所示。
23、第二方面，本发明提供了包含所述lamp引物组的检测试剂或者试剂盒。
24、第三方面，本发明提供了所述lamp引物组，或者包含所述lamp引物组的检测试剂或者试剂盒在检测福氏志贺菌血清型中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的。
25、第四方面，本发明提供了检测福氏志贺菌血清型的方法，包括以下步骤：
26、1)提取待测样品中的dna；
27、2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用权利要求1-4任意一项所述lamp引物组进行lamp扩增反应；
28、3)扩增结果判定；
29、所述方法为非疾病诊断和治疗目的。
30、优选地，步骤2)所述lamp扩增反应的体系按20μl反应体系计，包括10 μl2x bcabest buffer（takara公司产品），引物混合物1.5 μl（fip 和bip引物 40 pmol, f3和b3引物10 pmol, lf 和/或 lb 引物20 pmol）,bcabest dna polymerase ver.2.0 (8u/μl) 0.4μl, 羟基萘酚蓝（hnb染料）2μl和dna模板2μl, 最终用无菌水补充至20μl。
31、优选地，步骤2)所述lamp扩增反应的条件为61℃，40min。
32、优选地，步骤3)采用如下①～③中的任一种方法进行扩增结果判定：
33、①肉眼观察颜色变化：扩增反应结束后，根据反应前后反应体系颜色的变化来判定目标基因的扩增情况；
34、②琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有目标基因；
35、③焦磷酸镁浊度检测法：利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，，浊度大于0.1为阳性。
36、有益效果：
37、本发明提供了一种基于lamp技术的福氏志贺菌血清型鉴定用引物组合物及其在快速检测福氏志贺菌全部19个血清型中的应用。本发明设计了o抗原决定基因（ gtrⅰ、gtrⅰ c、oac、gtrⅳ、gtrⅴ和 oacc基因）的6套lamp引物，与zl2021107109927专利中的 gtrii、gtrx和 opt基因的3套lamp引物组成9套引物，可实现针对福氏志贺菌全部19个血清型的准确鉴定。本发明具有操作简单，快速高效，不需要昂贵设备的优点，配置好反应体系后，加入水煮模版，61℃水浴箱孵育40min后，肉眼即可观察结果。本发明具有高灵敏度、高特异性的优点，针对 gtrⅰ、gtrⅰc、oac、gtrⅳ、gtrⅴ和 oacc的6套lamp引物对福氏志贺菌水煮模板的灵敏度均大于10 pg/μl。
1.用于检测福氏志贺菌血清型的lamp引物组，其特征在于，包括用于检测福氏志贺菌gtrⅰ、gtrⅰc、oac、gtrⅳ、gtrⅴ和oacc基因的lamp引物，
2.根据权利要求1所述的lamp引物组，其特征在于，用于检测福氏志贺菌gtrⅰ基因的lamp引物还包括：环引物gtrⅰ-lf和gtrⅰ-lb，其核苷酸序列依次如seq id no.5~6所示；
3.根据权利要求1或2所述用于检测福氏志贺菌血清型的lamp引物组，其特征在于，还包括用于检测福氏志贺菌gtrii、gtrx和opt基因的lamp引物，
4.根据权利要求3所述用于检测福氏志贺菌血清型的lamp引物组，其特征在于，用于检测福氏志贺菌gtrii基因的lamp引物还包括：环引物gtrii-lf和gtrii-lb，其核苷酸序列依次如seq id no.16~17所示；
5.含有权利要求1-4任意一项所述lamp引物组的检测试剂或者试剂盒。
6.权利要求1-4任意一项所述lamp引物组，或者权利要求5所述试剂或者试剂盒在检测福氏志贺菌血清型中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的。
7.检测福氏志贺菌血清型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述检测福氏志贺菌血清型的方法，其特征在于，步骤2)所述lamp扩增反应的体系按20μl反应体系计，包括10 μl 2x bcabest buffer，引物混合物1.5 μl，8u/μl的bcabest dna polymerase ver.2.0 0.4μl，羟基萘酚蓝2μl和dna模板2μl,最终用无菌水补充至20μl；在所述引物混合物中，fip和bip引物的浓度各自为40pmol，f3和b3引物的浓度各自为10pmol，lf和/或lb引物的浓度各自为20pmol。
9.根据权利要求7或8所述检测福氏志贺菌血清型的方法，其特征在于，步骤2)所述lamp扩增反应的条件为61℃，40min。
10.根据权利要求7-9任意一项所述检测福氏志贺菌血清型的方法，其特征在于，步骤3)采用如下①～③中的任一种方法进行扩增结果判定：
