本发明属生物，具体涉及一种检测新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1变异株的rt-qpcr方法。
背景技术：
1、新型冠状病毒具有多种变种，其中omicron变种具有传染性和疫苗逃逸突变。目前，ba.2谱系有57个突变，其中31个在s蛋白中。s蛋白的受体结合域(rbd)负责与宿主受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合，并有可能增加感染性并介导疫苗诱导的中和抗体的逃逸。因此，位于s蛋白rbd的突变引起了极大的研究关注。
2、新冠病毒ba.2.12.1是奥密克戎ba.2变异毒株的下一代，ba.2传播力至少比ba.1高30％，ba.2.12.1的传播力估计比其前身ba.2还要高23％至27％，凭借其强传染性以及快速且隐匿的传播性，该毒株在病毒s蛋白的t19i、l452q、s704l位点发生重要变异。
3、奥密克戎被认为是迄今为止最具传染性的新冠变异毒株，而ba.2.12.1又是众多奥密克戎子变体中传播速度最快的。因此，目前亟需一种新冠病毒ba.2.12.1变异株的快速检测方法。
4、核酸检测技术是基于核酸双链互补配对原则的核酸杂交技术技术人员合成一段与特定病原体dna或者rna互补的单链核酸序列作为探针，并用生物素、放射性同位素、酶等进行标记，让其与待测病原体的核酸进行杂交。pcr技术的应用使待检测的病原体核酸数量可以成千上万地扩增，大大提高了核酸检测技术的应用性和准确性。
技术实现思路
1、本发明第一方面的目的，在于提供一种试剂。
2、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒的应用。
4、本发明第四方面的目的，在于提供一种检测新型冠状病毒的rt-qpcr检测方法。
5、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
6、本发明的第一个方面，提供一种试剂，包括引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示，
7、orf1ab-f：5’-atactgagtcctctttatgcatttgc-3’，
8、orf1ab-r：5’-gtgcgggagaaaattgatcgta-3’，
9、orf1ab-p：5’-cagaggctgctcgtgtt-3’；和/或
10、s-t19i-f：5’-cattcaactcaggatttgttcttacc-3’，
11、s-t19i-r：5’-tggtcccagagacatgtatagca-3’，
12、s-t19i-p：5’-tgttacttggttccatgcta-3’；和/或
13、s-l452q-f：5’-agcttgattctaaggttggtggtaa-3’，
14、s-l452q-r：5’-ggaaaccatatgatcgtaaaggaaa-3’，
15、s-l452q-p：5’-accagtatagattgtttaggaagtc-3’；和/或
16、s-s704l-f：5’-ctaagtctcatcggcgggca-3’，
17、s-s704l-r：5’-tgatgtcttggtcatagacactgg-3’，
18、s-s704l-p：5’-tgtagctagtcaatccatca-3’。
19、在本发明一些实施方式中，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团。
20、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团为fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red和cy5中的至少一种。
21、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种。
22、在本发明一些实施方式中，所述荧光基团连接在探针的5’端。
23、在本发明一些实施方式中，所述淬灭基团连接在探针的3’端。
24、在本发明一些优选实施方式中，所述orf1ab-p的5’端连接荧光基团fam，3’端连接淬灭基团bhq1。
25、在本发明一些优选实施方式中，所述s-t19i-p的5’端连接荧光基团texas red，3’端连接淬灭基团bhq2。
26、在本发明一些优选实施方式中，所述s-l452q-p的5’端连接荧光基团hex，3’端连接淬灭基团bhq1。
27、在本发明一些优选实施方式中，所述s-s704l-p的5’端连接荧光基团vic，3’端连接淬灭基团bhq1。
28、本发明的第二个方面，提供一种包含本发明第一方面的试剂的试剂盒。
29、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包括pcr反应液和阳性标准品。
30、在本发明一些实施方式中，所述pcr反应液包括质粒模板、引物、探针、2×taq prohs universal u+prob e master mix(包含dna聚合酶、dntps、缓冲液、镁离子)。
31、在本发明一些实施方式中，所述阳性标准品为新冠假病毒rna。
32、本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的试剂或本发明第二方面的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
33、(1)鉴别新型冠状病毒；
34、(2)制备检测或辅助检测新型冠状病毒的产品；
35、(3)检测待测样品是否为新型冠状病毒；
36、(4)制备检测或辅助检测待测样品是否为新型冠状病毒的产品；
37、(5)检测待测样品是否感染新型冠状病毒；
38、(6)制备检测或辅助检测待测样品是否感染新型冠状病毒的产品；
39、上述应用用于非疾病的诊断和治疗。
40、在本发明一些实施方式中，所述新型冠状病毒为新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1变异株。
41、本发明的第四个方面，提供一种检测新型冠状病毒的rt-qpcr检测方法，包括使用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
42、在本发明一些实施方式中，所述检测方法包括以下步骤：
43、1)从待测样品中提取核酸；
44、2)以步骤1)的核酸为模板，用所述试剂或所述试剂盒进行rt-qpcr扩增反应，收集荧光信号；
45、3)根据荧光信号判定待测样品中是否含有或是新型冠状病毒。
46、本发明采用多突变位点检测进行变异毒株鉴别的改进pcr方法，通过rt-qpcr替代基因测序的rt-pcr扩增-pcr产物纯化-上机测试等繁琐操作步骤，缩短了检测鉴定的时间，可应用于多数检测单位配备的荧光定量pcr仪即可完成对病毒变异株的准确鉴定，克服对昂贵测序仪的依赖，降低了测试的成本，增加新冠病毒变异株检测方法的普适性。通过96孔rt-qpcr反应板，并借助taqman探针法qpcr的高灵敏度、低成本的点，实现新冠病毒变异株的高灵敏度、高通量、低成本检测。
47、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为200～600nm，上/下游引物终浓度为200～700nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
48、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为250～500nm，上/下游引物终浓度为400～500nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
49、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为500～600nm，上/下游引物终浓度为450～500nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
50、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应程序为：40～55℃，4～6min；94～96℃，20～40s；94～96℃，2～10s，55～65℃，15～30s，35～45个循环。
51、在本发明一些实施方式中，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应程序为：50～55℃，5～6min；94～96℃，30～40s；95～96℃，5～10s，60～65℃，20～30s，35～40个循环。
52、在本发明一些实施方式中，所述检测方法的结果判定方法为：在实验成立的基础上(即阴性对照品无ct值，且无规则扩增曲线，同时阳性对照品ct值应小于35)，若fam、vic、hex、texas red通道ct≥35，判定为无新型冠状病毒感染；fam通道ct≤35，vic、hex、texasred通道ct≥35，判定为2019-ncov原始株阳性；fam、vic、hex、texas red通道ct≤35，判定为ba.2.12.1变异毒株；fam、vic、hex、texas red通道为其余情况，结果无效，建议复查。
53、在本发明一些实施方式中，所述新型冠状病毒为新型冠状病毒奥密克戎ba.2.12.1变异株。
54、本发明的有益效果是：
55、本发明提供的试剂可用于对新冠病毒进行检测，可快速检测鉴定新冠病毒，且具备极高的检测敏感性与特异性，检测结果准确可靠。
56、本发明提供的rt-qpcr检测方法具有以下优点：
57、提高检测速度，减少对昂贵仪器的依赖。该专利技术在新型冠状病毒突变体鉴定中的应用速度从6到8小时缩短到1小时，而且这种技术方法不依赖昂贵的测序仪，只需要普通的荧光光学定量pcr仪就可完成，减少对测序仪等昂贵仪器的依赖，节省样本转移时间，最大程度减少不可控因素。
58、提高检测灵敏度。基于taqman探针法rt-qpcr检测病毒核酸变异，检测灵敏度可高达1拷贝/微升，rt-qpcr扩增信号可实现病毒核酸变异检测，避免微弱的扩增信号对基于基因测序对核酸变异检测的影响。
59、降低检测成本，提高检测通量。该技术的整个实验过程仅包括病毒核酸的提取和qrt pcr两步，实验步骤少，所需材料和人工成本大大降低，可通过96或384孔反应板，方便实现样品的高通量。
60、污染率低，易于操作。通过当前的测序技术检测病毒突变需要病毒rna提取、rt-pcr扩增、pcr产物纯化、机器测序等步骤，批量操作容易引入操作污染，此方法只需病毒rna提取和rt-qpcr两步操作，步骤减少相应操作污染也减少，很容易实现一次检测大量样本。
61、单独使用或与其他引物探针结合使用时，每个鉴别位点的引物探针的性能是不同的：单独使用时不受其他引物影响。与其他引物结合时，易受其影响，需相互鉴别对引物探针用量、反应条件、阳性结果判定阈值等位点进行了优化。
1.一种试剂，包括引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示，
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述探针的序列两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述荧光基团为fam、hex、vic、tamra、rox、texas-red和cy5中的至少一种；和/或，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3中任一项所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应液和阳性标准品。
6.权利要求1～3中任一项所述的试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在(1)～(6)中任一项的应用：
7.一种检测新型冠状病毒的rt-qpcr检测方法，包括使用权利要求1～3中任一项所述的试剂和/或权利要求4或5所述的试剂盒进行检测的步骤，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应体系为：pcr反应液10～15μl，探针终浓度为200～600nm，上/下游引物终浓度为200～700nm，核酸1～3μl，无酶水加至20μl。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤2)中所述rt-qpcr扩增反应程序为：40～55℃，4～6min；94～96℃，20～40s；94～96℃，2～10s，55～65℃，15～30s，35～45个循环。
