本发明涉及一种米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，属于纳米颗粒制备。
背景技术：
1、我国作为世界上米糠资源第一大国，每年产出的米糠达到千万吨级别，米糠的可利用资源非常丰富。在米糠中，含有多种营养基质和生理活性物质，包括被视作新兴优质植物蛋白的米糠蛋白。但目前米糠的使用主要是作为锅炉燃料、动物饲料，或是直接丢弃的农业废料，其农副产品的附加值未能得到充分的开发，对环境和资源造成了极大的破坏和浪费。因此，对米糠进行综合加工利用，推进其在食品工业中的应用十分必要。
2、已有专利《一种用于封装递送原青花素的大豆蛋白纳米颗粒的制备方法》(cn202410240169.8)，通过对大豆蛋白超声及酶解处理，使纳米颗粒对原青花素达到更好的包封效果。本专利采用ph循坏法制备米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖(r-e-c)三元纳米颗粒，对表没食子茶素没食子酸酯起到了保护作用，减少了其因环境因素造成的活性损失，提高了其生物利用率，延长表没食子茶素没食子酸酯抗氧化效果，同时，egcg含有丰富的羟基，使其能够与蛋白等其他化合物之间形成氢键，因此对蛋白结构可以起到良好的修饰作用。但单一的蛋白纳米颗粒载体易受外界环境的影响，因此，向蛋白-多酚体系中加入生物安全、性能优良的羧甲基壳聚糖，可以赋予纳米颗粒更好的结构和功能特性，为今后开发新型载体材料提供新方法和新思路。
技术实现思路
1、本发明提出一种米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，不仅保证了纳米颗粒中表没食子茶素没食子酸酯的生物活性，也可以提高蛋白纳米颗粒的稳定性，赋予其更好的功能性质。
2、本发明采用如下技术方案：一种米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
3、1)米糠蛋白提取：将脱脂米糠与去离子水混合，均质后于常温下搅拌，将混合液的ph值调为碱性，搅拌，过滤除去米糠渣后离心，将离心后所得上清液的ph值调为酸性，静置后离心，收集离心后所得沉淀并稀释，将其ph值调至中性，冷冻干燥后得到米糠蛋白rbp；
4、2)储备液制备：取步骤1)中米糠蛋白rbp溶解于去离子水中，使用1m的naoh调节溶液ph值，室温下搅拌，随后将米糠蛋白rpb溶液于4℃下水合过夜，制得rbp储备液；
5、3)米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯r-e纳米颗粒的制备：取步骤2)中rbp储备液与表没食子茶素没食子酸酯egcg混合，添加去离子水控制溶液总固形物浓度，用1m的naoh溶液调节混合液ph值至碱性，持续搅拌24h，并在8000～14000kda的透析袋中4℃透析48h，每6～8h换一次水，得到r-e纳米颗粒溶液，冷冻干燥制得r-e纳米颗粒；
6、4)米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖r-e-c纳米颗粒的制备：采用ph循环法，将冷冻干燥后的r-e纳米颗粒粉末溶解于去离子水中，加入羧甲基壳聚糖cmcs，并添加去离子水控制溶液总固形物浓度，磁力搅拌，混合均匀后用0.1m的hcl溶液缓慢调整混合体系的ph值至酸性，继续磁力搅拌，最后将混合体系的ph值调为中性，于离心，取上清液，得到r-e-c纳米颗粒溶液，冷冻干燥制得r-e-c纳米颗粒。
7、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，步骤1)具体为：将脱脂米糠与去离子水按1：5的比例混合，均质4～6min后于常温下磁力搅拌1～2h，使用1m的naoh将混合液的ph值调为9.5，55℃磁力搅拌1～2h，过滤除去米糠渣后10000r/min离心30min，使用1m的hcl将离心后所得上清液的ph值调为4.4，静置30～40min后10000r/min离心30min，收集离心后所得沉淀并稀释，将其ph值调至中性，冷冻干燥后得到米糠蛋白。
8、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤2)中，米糠蛋白rbp储备液的浓度为10mg/ml，ph值为12.0。
9、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤3)中，表没食子茶素没食子酸酯egcg的添加量是米糠蛋白rbp质量的1.5％～3.5％。
10、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤3)中，所述的控制溶液总固形物浓度是总固形物浓度为0.1％，体系ph为9.0。
11、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤4)中，冷冻干燥后的r-e纳米颗粒溶于去离子水中的浓度为10mg/ml。
12、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤4)中，羧甲基壳聚糖cmcs的添加量与r-e纳米颗粒的质量比为2:1～6:1。
13、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤4)中，r-e-c纳米颗粒溶液总固形物浓度为0.2％～0.5％。
14、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，所述步骤4)中，所述的调整混合体系的ph值至酸性是ph为2.5～4.5。
15、上述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，步骤3)、4)中冷冻干燥条件为：在-20℃下预冻24h后置于冻干机中，0.1～0.5mbar、-60～-50℃下冷冻干燥48h。
16、通过本发明，提供的一种米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，相对于现有技术，本发明方法具有以下有益效果：
17、1.本发明利用ph循坏法将羧甲基壳聚糖修饰到r-e纳米颗粒表面，羧甲基壳聚糖生物活性独特、生理功能丰富，整个纳米颗粒制备方法及制备过程简单快捷、产率高。
18、2.本发明利用羧甲基壳聚糖和米糠蛋白，减少了表没食子茶素没食子酸酯因环境因素造成的活性损失，提高了其生物利用率，并且纳米颗粒具备控制释放的能力，能够延长表没食子茶素没食子酸酯的抗氧化性。
19、3.本发明充分利用ph循坏法制备出蛋白-多酚-多糖三元纳米颗粒，有效增强了蛋白纳米颗粒的功能性质，并且在制备过程中不添加化学乳化剂，绿色安全，使所制备的纳米颗粒应用潜能进一步扩大。
20、4.本发明将粮油加工副产物--米糠加以利用，提取米糠蛋白作为纳米颗粒载体，节约了农作物资源，提高了米糠的应用价值。
21、5.本发明所制得的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖三元纳米颗粒的粒径为112.1～566.3nm，pdi为0.141～0.696，zeta电位为-29.4～-14.0mv，浊度为0.0576～1.2466。
1.一种米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：将脱脂米糠与去离子水按1：5的比例混合，均质4～6min后于常温下磁力搅拌1～2h，使用1m的naoh将混合液的ph值调为9.5，55℃磁力搅拌1～2h，过滤除去米糠渣后10000r/min离心30min，使用1m的hcl将离心后所得上清液的ph值调为4.4，静置30～40min后10000r/min离心30min，收集离心后所得沉淀并稀释，将其ph值调至中性，冷冻干燥后得到米糠蛋白。
3.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，米糠蛋白rbp储备液的浓度为10mg/ml，ph值为12.0。
4.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，表没食子茶素没食子酸酯egcg的添加量是米糠蛋白rbp质量的1.5％～3.5％。
5.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述的控制溶液总固形物浓度是总固形物浓度为0.1％，体系ph为9.0。
6.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，冷冻干燥后的r-e纳米颗粒溶于去离子水中的浓度为10mg/ml。
7.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，羧甲基壳聚糖cmcs的添加量与r-e纳米颗粒的质量比为2:1～6:1。
8.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，r-e-c纳米颗粒溶液总固形物浓度为0.2％～0.5％。
9.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述的调整混合体系的ph值至酸性是ph为2.5～4.5。
10.根据权利要求1所述的米糠蛋白-表没食子茶素没食子酸酯-羧甲基壳聚糖纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤3)、4)中冷冻干燥条件为：在-20℃下预冻24h后置于冻干机中，0.1～0.5mbar、-60～-50℃下冷冻干燥48h。
