本发明涉及食品，尤其是涉及一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂及其应用。
背景技术：
1、茶多酚(tea polyphenols，tp)多种保健功能和药理作用相继被发现，可作为一种理想的天然药物和天然无毒的抗氧化剂。茶多酚抗氧化作用可以有效阻止或抑制氧化酶活性、中断氧化过程中的链式反应，从而表现出较强的抗氧化和清除自由基的能力，进而保护细胞免受氧化损伤，使得茶多酚具有抗癌、抗突变、抗肿瘤、降血糖等生物活性。茶多酚能够通过影响糖代谢和胰岛素抵抗等途径，发挥降血糖的作用，能够作为潜在的功能性食品调控机体健康。茶多糖(tea polysaccharide，tps)在中国和日本的传统医学中被广泛应用于糖尿病的治疗。tps对人体中的糖代谢相关酶系具有较强的抑制作用并且其降血糖活性具有浓度依赖性，这为其作为潜在药物的合理用量提供了参考，这些发现拓展了对天然植物多糖在治疗糖尿病中的潜在应用范围，为开发新的糖尿病治疗药物提供了重要线索和研究方向。
2、茶叶可看成一种具有多种活性成分的“复方”剂，这些活性成分通常与茶多糖结合在一起出现在粗tps中。茶多糖能够较好地调控肝脏中的糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，而红茶茶多酚则改善了血清和肝脏脂质水平、抗氧化能力、内脏脂肪重量和粪便脂肪酸含量。粗老绿茶和黑茶多糖在体内外均具有良好的降血糖功效，能够显著抑制α-葡萄糖苷酶和β-淀粉酶的活性并延缓葡萄糖的吸收；六堡茶可通过调控高血糖小鼠模型体内肠道菌群，激活肝脏pi3k-akt信号通路缓解高血糖、胰岛素抵抗及其相关的代谢紊乱。多酚、多糖在体外实验和动物水平上已被证实具有协同降糖控脂作用。目前关于茶多酚与茶多糖相互作用的报道较少，茶多糖-茶多酚复配物的生物活性与其相互作用关系密切，通过挖掘茶多糖-茶多酚复配物的构效关系可以为高活性功能性食品的开发提供指导。因此，未来的研究需要进一步深入探讨茶叶中活性成分的作用机制，为茶叶的药用价值和新药开发提供科学依据。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂及其应用，将纯化后的绿茶细胞壁多糖与茶多酚按不同比例复配，探究不同比例绿茶细胞壁多糖/茶多酚复配物的体外糖代谢酶抑制活性和结构差异以及体内对高血糖小鼠的降血糖作用，最终筛选出降血糖活性最佳的复配比例，为降血糖功能产品的研发提供重要参考。
2、本发明的目的通过以下技术方案实现：
3、本发明的第一个目的是提供一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，所述膳食营养补充剂包括活性成分；所述活性成分包括纯化后的绿茶细胞壁多糖与茶多酚；所述活性成分中，纯化后的绿茶细胞壁多糖与茶多酚的质量比为1:3～3:1。
4、进一步地，所述膳食营养补充剂的制备方法包括以下步骤：将纯化后的绿茶细胞壁多糖与茶多酚进行自组装复配，以改善绿茶细胞壁多糖的溶解性。
5、进一步地，所述膳食营养补充剂的制备方法具体包括以下步骤：称取纯化后的绿茶细胞壁多糖(p4m-tps)和茶多酚(tp)，加入超纯水进行溶解混合搅拌均匀，将混合溶液过0.22μm滤膜后，将滤液冷冻干燥，获得纯化后的绿茶细胞壁多糖和茶多酚复配物，命名为p4m-tps-tp。
6、进一步地，所述膳食营养补充剂的制备方法具体包括以下步骤：称取纯化后的绿茶细胞壁多糖(p4m-tps)和茶多酚(tp)于锥形瓶中，加入超纯水进行溶解，按照不同质量浓度比(p4 m-tps/tp为1:1、1:2、2:1、1:3和3:1)混合搅拌均匀，将混合溶液过0.22μm滤膜后，将滤液冷冻干燥，获得纯化后的绿茶细胞壁多糖和茶多酚复配物(p4 m-tps和tp复配物)，命名为p4 m-tps-tp。
7、进一步地，所述膳食营养补充剂还包括药学上可接受的辅料。
8、进一步地，所述辅料选自淀粉、糊精、纤维素、纤维素衍生物或低聚糖中的一种或多种。
9、进一步地，所述膳食营养补充剂包括以下重量份的原料：纯化后的绿茶细胞壁多糖1份，茶多酚2份，甜菊素c 0.2-0.8份，维生素d2 0.2-0.8份，亮氨酸0.2-0.8份。进一步地，所述膳食营养补充剂为的剂型选自片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂或丸剂中的一种。
10、进一步地，所述膳食营养补充剂的活性成分为基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的复配物，所述基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的复配物的制备方法为：
11、将纯化后的茶细胞壁多糖与多酚进行自组装复配，改善纯化后的茶细胞壁多糖的溶解性。具体包括以下步骤:称取p4m-tps和tp于锥形瓶中，加入超纯水进行溶解，按照不同质量浓度比(p4 m-tps/tp为1:1、1:2、2:1、1:3和3:1)混合搅拌均匀，将混合溶液过0.22μm滤膜后，将滤液冷冻干燥，获得p4m-tps和tp复配物，命名为p4 m-tps-tp。
12、进一步地，所述纯化后的绿茶细胞壁多糖的制备方法包括如下步骤：
13、绿茶经过水、环己烷二胺四乙酸、碳酸钠以及不同浓度的氢氧化钠溶液进行顺序提取，再经过除杂、透析和冷冻干燥，获得纯化后的绿茶细胞壁多糖。
14、进一步地，所述纯化后的绿茶细胞壁多糖的制备方法具体包括以下步骤：
15、(1)绿茶茶叶磨碎后过80目网筛，得到茶粉，茶粉按料液比为1：20的比例加入超纯水，37℃水提2h，随后离心(5000rpm，10min)取上清液，将沉淀重复上述步骤提取至上清液中不再检测到糖含量，将上清液合并使用7000da的透析袋进行72h透析，所述上清液为提取液，保留茶渣并进行烘干，得到烘干的茶渣，用于后续步骤；按提取液：乙醇＝1：3的体积比例加入乙醇，4℃静置过夜，随后离心(5000rpm，10min)收集沉淀；将沉淀用水复溶后离心取上清液，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥(48h)后获得水提多糖(water-extracted teapolysaccharides，w-tps)。
16、(2)步骤(1)得到的烘干的茶渣按料液比为1：10的比例加入70％乙醇，室温下摇床震荡12h，溶液离心收集沉淀，沉淀用70％乙醇反复洗涤3-5次，用无水乙醇洗一次，随后将沉淀置于通风橱晾干，得到醇不溶性的茶渣；将醇不溶性的茶渣按料液比为1：10的比例加入tris-马来酸缓冲液，所述tris-马来酸缓冲液的浓度为20mmol/l，所述tris-马来酸缓冲液的ph为6.9，加入2mmol/l cacl2和淀粉酶，淀粉酶和醇不溶性的茶渣的比例为20mg淀粉酶/5g茶渣，37℃下摇床震荡4h以除去淀粉，获得除去淀粉的茶渣，将除去淀粉的茶渣洗涤3-5次后离心取沉淀放置于通风橱中干燥，将干燥后的除去淀粉的茶渣按料液比为1：10的比例加入环己烷二胺四乙酸溶液，所述环己烷二胺四乙酸溶液的浓度为50mmol/l，所述环己烷二胺四乙酸溶液的ph为6.5，在37℃下摇床震荡提取12h，随后离心并将上清液使用7000da的透析袋进行72h透析，得到沉淀和提取液，对沉淀进行3-5次洗涤后，放置于通风橱中干燥，得到经cdta提取后的茶渣；透析完成后，按提取液：乙醇＝1：3的比例加入乙醇，4℃静置过夜，然后离心取沉淀。将沉淀用水复溶后离心取上清，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥后获得cdta提取的多糖(cdta-extracted tea polysaccharides，c-tps)。
17、(3)将步骤(2)得到的经cdta提取后的茶渣按1：10的料液比例加入饱和碳酸钠溶液，并在溶液中加入25mmol/l的nabh4以保护多糖，在37℃下摇床震荡提取12h，离心后上清液使用7000da的透析袋进行72h透析，得到沉淀和提取液，对沉淀进行3-5次洗涤后，进行干燥，得到经饱和碳酸钠提取后的茶渣；按提取液：乙醇＝1：3的体积比例加入乙醇，4℃静置过夜，然后离心取沉淀；将沉淀用水复溶后离心取上清液，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥后获得碳酸钠提取的多糖(na2co3-extracted tea polysaccharides，n-tps)。
18、(4)将步骤(3)得到的经饱和碳酸钠提取后的茶渣按1：10的料液比例加入1mol/lnaoh溶液，并在溶液中加入25mmol/l的nabh4以保护多糖，37℃下摇床震荡提取12h，离心后上清液使用7000da的透析袋进行72h透析，得到沉淀和提取液，对沉淀进行3-5次洗涤后，进行干燥，得到经1mol/l naoh溶液提取后的茶渣；按提取液：乙醇＝1：3的体积比例加入乙醇，4℃静置过夜，离心收集沉淀；将沉淀用水复溶后离心取上清，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥后获得1mol/l naoh溶液提取的多糖(1m naoh-extracted teapolysaccharides，1m-tps)。
19、(5)将步骤(4)得到的经1mol/l naoh溶液提取后的茶渣按1：10的料液比例加入4mol/l naoh溶液，并在溶液中加入25mmol/l的nabh4，37℃下摇床震荡提取12h，离心后上清液使用7000da的透析袋进行72h透析，得到沉淀和提取液；旋蒸浓缩后按照水提取液与乙醇1：3的体积比例加入乙醇，4℃静置过夜，离心取得沉淀；将沉淀用水复溶后离心取上清，重复3次，合并上清液，经冷冻干燥后获得4mol/l naoh溶液提取的多糖(4m naoh-extracted tea polysaccharides，4m-tps)。
20、(6)当使用磷酸盐缓冲液(pbs)作为洗脱液时，洗脱出了大量的茶多糖。然而，随后使用浓度梯度的氯化钠溶液进行洗脱时，检测到的多糖洗脱量很少。因此，选择在pbs条件下洗脱和收集的组分，将其合并、浓缩并冷冻干燥，以获得纯化的茶多糖，命名为p4m-tps。
21、进一步地，步骤(6)包括如下步骤：将4mol/l naoh溶液提取的多糖溶于磷酸盐缓冲溶液pbs(ph＝6.8，0.02mol/l)中，溶解至多糖溶液浓度为50mg/ml，经0.22μm滤膜过滤后，对装有deae-sepharose fast flow gel填料的凝胶柱冲洗至平衡后上样，用滴管将多糖溶液缓慢均匀滴加至阴离子凝胶柱中(2.5cm×60cm)，待稳定后打开走液开关，依次用含0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/l nacl的pbs缓冲溶液梯度洗脱，待洗脱至无糖检出后切换浓度梯度。实验利用自动收集器收集洗脱液(2ml/min，2min/管)，使用苯酚-硫酸法对收集的液体进行总糖含量测定，以其在490nm下的od值为纵坐标，管数作为横坐标绘制洗脱曲线。对单一峰下的洗脱液进行合并，浓缩后使用3500da的透析袋对洗脱液进行透析72h，冻干后得到纯化的茶多糖，命名为p4m-tps。本发明的第二个目的是提供一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂在制备调节糖脂代谢、降低氧化应激、改善机体炎症反应的药品或保健品中的应用。
22、进一步地，药品或保健品的说明书中记载：控制绿茶细胞壁多糖和茶多酚的复配物的摄入量为350-450mg/d。
23、与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几个方面：
24、1)本发明提出的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂及其应用，所提供的膳食营养补充剂可以调节糖脂代谢，降低氧化应激，改善机体炎症反应，在高血糖/糖尿病患者群体中具有良好的应用前景；
25、2)本发明提出的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂及其应用，通过将纯化后的绿茶细胞壁多糖与茶多酚按不同比例复配，探究不同比例绿茶细胞壁多糖/茶多酚复配物的体外糖代谢酶抑制活性和结构差异以及体内对高血糖小鼠的降血糖作用，最终筛选出降血糖活性最佳的复配比例。
26、3)本发明提出的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂及其应用，将顺序提取得到的4m氢氧化钠提取的多糖纯化后，得到包括中性糖、糖醛酸和还原糖的纯化后的茶细胞壁多糖，茶多糖和茶多酚的组合物对糖代谢相关酶(α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和蔗糖酶)的抑制活性强于任何单一成分，当p4m-tps/tp的比例为1:1、1:2和2:1时，组合物的抑制作用明显，对α-葡萄糖苷酶的ic50值分别为6.970、6.493和5.673μg/ml，对α-淀粉酶的ic50值分别为2.934、4.458和5.057mg/ml，对蔗糖酶的ic50值分别为4.003、2.029和2.692mg/ml。
1.一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述膳食营养补充剂包括活性成分；
2.根据权利要求1所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述膳食营养补充剂的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述膳食营养补充剂的制备方法具体包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述膳食营养补充剂还包括药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求5所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述辅料选自淀粉、糊精、纤维素、纤维素衍生物或低聚糖中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述膳食营养补充剂包括以下重量份的原料：纯化后的绿茶细胞壁多糖1份，茶多酚2份，甜菊素c 0.2-0.8份，维生素d2 0.2-0.8份，亮氨酸0.2-0.8份。
7.根据权利要求1所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述膳食营养补充剂为的剂型选自片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂或丸剂中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂，其特征在于，所述纯化后的绿茶细胞壁多糖的制备方法包括如下步骤：
9.一种如权利要求1-8中任一项所述基于绿茶细胞壁多糖和茶多酚的调节糖代谢的膳食营养补充剂在制备调节糖脂代谢、降低氧化应激、改善机体炎症反应的药品或保健品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，药品或保健品的说明书中记载：控制绿茶细胞壁多糖和茶多酚的复配物的摄入量为350-450mg/d。
