本发明属于柑橘黄龙病防治领域，涉及多功能诊疗一体化纳米聚合物载体及其在制备柑橘黄龙病诊疗剂中的应用。
背景技术：
1、柑橘黄龙病菌是一种革兰阴性细菌，寄生在柑橘韧皮部筛管细胞，干扰线粒体和叶绿体正常功能，导致枝梢生长失绿黄化、果实着色异常或红鼻果、植株器官营养输送受阻或缺乏供给而枯死。柑橘黄龙病是柑橘生产上的毁灭性病害，一旦感染若不能及时发现，就会迅速传播蔓延，殃及整个果园。
2、目前，黄龙病的主要防治方法：一是传统的“三板斧”防治策略，即种植无病苗木、严防木虱和挖净病树；二是药物防治，主要包括抗生素化学药物、窄谱靶向化学药物、免疫诱导物、纳米制剂等在内的多种抗菌剂。抗生素对细菌感染的植物有着极强的疗效，农业领域商业化使用的抗生素有10余种(如四环素、青霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠、盐酸土霉素)，实施方法有传统叶面喷施和树干注射两种方式，以后者为主，研究结果表明抗生素的联合使用疗效优于单种药物。然而，大剂量纯抗生素治疗黄龙病存在药效时间短，无靶向性导致药物利用度不高，并且对柑橘树毒副作用大。
3、由于黄龙病菌未被成功分离，实验室也无法培养，这很大程度上阻碍了对该病菌的深入研究。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供多功能诊疗一体化纳米聚合物载体及其在制备柑橘黄龙病诊疗剂中的应用。本发明以柑橘树苗为研究对象，构建了抗体fab'片段靶向递送、荧光示踪、药物缓释的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体，用于研究柑橘树苗体内黄龙病菌的繁殖过程和抑制黄龙病菌繁殖。
2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、本发明的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体，包括：纳米载体、诊断成像剂、黄龙病菌抗菌药物和黄龙病菌靶向片段。
4、所述纳米载体为两亲性聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇-马来酰亚胺(plga-peg-mal)；所述诊断成像剂为荧光碳点，选用的碳点在pbs溶液中、紫外光源激发下，碳点发射波长与柑橘树苗体内发光化合物发射波长(背景荧光)不重叠；所述黄龙病菌抗菌药物包括疏水性药物和亲水性药物，如抗生素(主要包括青霉素类、氨基糖苷类、头孢菌素类和大环内酯类等)药物，免疫诱导药物(β-氨基丁酸、2,6-二氯异烟肼、抗坏血酸等)和金属纳米抗菌材料(纳米银、纳米铜、纳米氧化锌等)。所述黄龙病菌靶向片段为识别黄龙病菌外膜蛋白的抗体fab'片段，其赋予本发明的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体主动靶向功能，使其定点和高效富集于黄龙病菌病灶组织部位，以实现黄龙病菌的荧光标记和示踪以及药物疗效评价一体化的目的。
5、上述多功能诊疗一体化纳米聚合物载体的制备方法，包括以下内容：
6、步骤1：首先以开环聚合获得两亲性聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇-马来酰亚胺(plga-peg-mal)聚合物；
7、步骤2：然后采用复乳化溶剂挥发法用步骤1得到的聚合物装载黄龙病菌抗菌药物和荧光碳点制备载药荧光脂质体，其中，可通过调整聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)中聚乳酸(pla)和聚乙交酯(pga)链段比例以及聚乙二醇(peg)分子量来优化聚合物载体的粒径大小和载药量及包封率。
8、步骤3：最后，通过一步偶联反应将可特异性识别黄龙病菌外膜蛋白的抗体fab'片段修饰到脂质体表面，构建主动靶向黄龙病菌、荧光成像的载药脂质体。
9、作为优选方案，步骤1中，用分子量2000的马来酰亚胺封端的peg-oh为引发剂开环聚合丙交酯和乙交酯获得plga-peg-mal聚合物，所述丙交酯和乙交酯的质量比例为75：25。
10、步骤2中，步骤2.1：将荧光碳点在蒸馏水中超声分散，向其加入亲水性黄龙病菌抗菌药物，得水溶性药物溶液，溶液中荧光碳点的浓度是2～5％；亲水性黄龙病菌抗菌药物的浓度是4～7％；
11、取plga-peg-mal聚合物和疏水性药物加入到有机溶剂二氯甲烷中，得疏水性药物溶液，溶液中聚合物浓度为60～80％；疏水性药物的浓度是5～10％；
12、步骤2.2：将水溶性药物溶液滴加到疏水性药物溶液中，间歇性超声乳化，待形成稳定初乳后，滴加到1％pva溶液中，间歇性超声乳化获得w/o/w型复乳液，接着将复乳液滴加到蒸馏水中，搅拌，挥发除去二氯甲烷后离心，取沉淀用蒸馏水洗涤，除去未包封药物和碳点及pva，分散在pbs溶液中，即得；
13、所述水溶性药物溶液和疏水性药物溶液的体积比是3：1，初乳和1％pva溶液的体积比是1：2，复乳液和蒸馏水的体积比是1：2。
14、本发明还提供了多功能诊疗一体化纳米聚合物载体在制备黄龙病诊疗剂中的应用。本发明的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体用于柑橘后，不仅可以实现抗菌药物靶向治疗，还通过植物活体光学成像系统实时和动态监测黄龙病菌在柑橘植株体内分布、繁殖和扩散。
15、本发明的有益效果在于：
16、本发明的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体不仅能够在表面抗体fab'片段引导下，主动靶向递送药物至病灶部位，并借助聚合物载体降解和病菌分泌物共同促进药物释放，利用荧光碳点对柑橘树苗体内靶向纳米载体进行荧光示踪和黄龙病菌荧光标记，通过植物活体光学成像系统实时和动态监测黄龙病菌在柑橘植株体内分布、繁殖和扩散以及抗菌药物靶向治疗效果。
17、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
1.多功能诊疗一体化纳米聚合物载体，其特征在于，包括：纳米载体、诊断成像剂、黄龙病菌抗菌药物和黄龙病菌靶向片段，所述纳米载体为两亲性聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇-马来酰亚胺；所述诊断成像剂为荧光碳点，所述黄龙病菌靶向片段为识别黄龙病菌外膜蛋白的抗体fab'片段。
2.根据权利要求1所述的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体，其特征在于，所述荧光碳点在pbs溶液中、紫外光源激发下，荧光碳点发射波长与柑橘树苗体内发光化合物发射波长不重叠。
3.根据权利要求1所述的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体，其特征在于，所述黄龙病菌抗菌药物包括疏水性药物和亲水性药物。
4.根据权利要求1所述的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体，其特征在于，所述黄龙病菌抗菌药物包括青霉素类药物、氨基糖苷类药物、头孢菌素类药物、大环内酯类药物、β-氨基丁酸、2,6-二氯异烟肼、抗坏血酸、纳米银、纳米铜、纳米氧化锌。
5.权利要求1所述的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体的制备方法，其特征在于，包括以下内容：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，用分子量2000的马来酰亚胺封端的peg-oh为引发剂开环聚合丙交酯和乙交酯获得plga-peg-mal聚合物，所述丙交酯和乙交酯的质量比例为75：25。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体为：
8.权利要求1-4任一项所述的多功能诊疗一体化纳米聚合物载体在制备黄龙病诊疗剂中的应用。
