本发明属于生物化工，具体涉及一种甲萘醌半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术：
1、甲萘醌，又称维生素k3，一种人工合成的脂溶性维生素，甲萘醌是凝血过程中不可或缺的维生素，它通过促进凝血因子ⅱ、ⅶ、ⅸ、ⅹ的γ-羧化，使这些因子具备与钙离子结合的能力，从而正常发挥凝血作用。此外，研究发现甲萘醌在骨骼健康中也扮演着重要角色。它能够促进骨基质中骨钙素的羧化，增强骨钙素与羟基磷灰石的结合能力，从而有助于骨骼矿化和维持骨密度。因此，准确测定甲萘醌对于评估个体凝血功能、骨骼健康、营养状况以及药物疗效等方面具有重要意义。
2、甲萘醌的测定方法包括仪器分析方法，高效液相色谱法(hplc)，hplc结合各种检测器如荧光、紫外和电化学等，液相色谱-质谱联用等方法。尽管这些方法在实际样品的测试中的精确性比较高，但是实际操作难度较高，对于操作人员技术要求比较高，检测成本高，且因其依赖于大型仪器，短时间不适合现场快速、高通量的检测和监控。免疫分析技术因其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，相比起依赖于仪器的检验方法，免疫分析技术可以补足仪器检测方法无法实现现场快速批量检测和监控的短板，使其达到筛选目的成为现实，为甲萘醌检测提供了一种新的检测途径。
3、基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法，高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点，在食品安全领域具有广阔的应用前景。对于免疫分析法而言，抗原抗体作为核心原料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的半抗原结构。只有合成、制备出合理结构的有效甲萘醌半抗原，才能够获得特异性强、灵敏度高的抗体。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明目的在于提供一种甲萘醌半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，本发明制得的甲萘醌半抗原在甲萘醌分子基础上进行设计，通过引入不饱和线性间隔臂以提高半抗原基人工抗原的高特异免疫原性；由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物所得抗血清效果，对甲萘醌的ic50达0.17ng/ml，灵敏度良好。
2、为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种甲萘醌半抗原，所述甲萘醌半抗原的分子结构如式(i)所示：
3、
4、式(i)。
5、第二方面，本发明提供了上述甲萘醌半抗原的制备方法，包括以下制备步骤：
6、将甲萘醌、3～巯基丙酸乙酯进行反应得到产物i，然后将产物i与氢氧化钠反应，制备得到产物ii，产物ii即为甲萘醌半抗原；
7、反应式为：
8、
9、作为优选，所述制备步骤具体为：
10、1)将甲萘醌溶解于二甲亚砜中，并加入na2co3，然后加入3-疏基丙酸乙酯，加热搅拌，待反应完全降至室温，得产物i粗产物；
11、2)向所述产物i粗产物中加入naoh溶液经过加热搅拌后加入3ml纯水，用盐酸调节ph至4～5，然后依次经过乙酸乙酯萃取、减压浓缩、硅胶柱层析纯化、浓缩后得到产物ii，即为甲萘醌半抗原。
12、作为优选，所述步骤1)中甲萘醌、二甲亚砜、na2co3、3-疏基丙酸乙酯的质量体积比为100mg～200mg：1ml～2ml：73.8mg～147.6mg：77.8～155.6。
13、作为优选，所述步骤1)中加热搅拌的温度为60℃～80℃；搅拌时间为10h～12h。
14、作为优选，所述步骤2)中产物i粗产物、naoh溶液、纯水的体积比为3：5：3。
15、作为优选，所述步骤2)中naoh溶液的浓度为0.2mol/l，所述盐酸的浓度为1.0mol/l。
16、作为优选，所述步骤2)中加热搅拌温度为60℃～80℃；搅拌时间为1h～2h。
17、第三方面，本发明提供了一种甲萘醌人工抗原，所述甲萘醌人工抗原由上述甲萘醌半抗原与大分子载体蛋白偶联得到；
18、所述大分子载体蛋白为血蓝蛋白或卵清蛋白；
19、所述甲萘醌人工抗原分子结构如式(ii)所示：
20、
21、第四方面，本发明提供了上述甲萘醌人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
22、将甲萘醌半抗原、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)按照比例1：3：3摩尔比溶解于800μl的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，4℃下搅拌0.5h然后离心取上清液得到活化甲萘醌半抗原衍生物。
23、将活化甲萘醌半抗原衍生物缓滴加至含有5mg/ml大分子载体蛋白的包被缓冲溶液中，4℃下搅拌反应12h；然后在4℃下用pbs透析三天，每天更换三次透析液，得到甲萘醌人工抗原，分装并低温保存备用；
24、所述甲萘醌半抗原与载体蛋白的摩尔比为1500：1～4500：1。
25、第五方面，本发明提供了一种甲萘醌人工抗原抗血清效果评价方法，由上述甲萘醌半抗原与血蓝蛋白偶联物作为免疫原，所述甲萘醌半抗原与卵清蛋白偶联物作为包被原，进行基于间接竞争酶联免疫分析方法检测，具体步骤如下：
26、选取balb/c小鼠进行免疫，首次免疫将甲萘醌半抗原与血蓝蛋白偶联物与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下多点注射；从首次免疫开始，第3周、6周和9周加强免疫，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法同首次免疫，剂量减半：最后一次加强免疫一周后取少量尾部静脉血，充分离心取上清检测效价和抑制率，建立间接酶联免疫分析方法标准曲线。
27、本发明的有益效果至少包括：
28、本发明提供了一种甲萘醌半抗原，该半抗原在甲萘醌分子基础上进行设计，通过引入不饱和线性间隔臂以提高半抗原基人工抗原的高特异免疫原性。同时，本发明提供由所述半抗原偶联载体蛋白制备的人工抗原，以及免疫实验动物所得抗血清效果，对甲萘醌的ic50达0.17ng/ml，灵敏度良好。本发明的抗原合成过程简单、抗体制备成本较低，为开发出成本低廉、检测效率高、操作简单的酶联免疫快速检测工具奠定基础，具有良好的应用前景。
1.一种甲萘醌半抗原，其特征在于，所述甲萘醌半抗原的分子结构如式(i)所示：
2.权利要求1所述的甲萘醌半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备步骤具体为：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中甲萘醌、二甲亚砜、na2co3、3-疏基丙酸乙酯的质量体积比为100mg～200mg：1ml～2ml：73.8mg～147.6mg：77.8mg～155.6mg。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中加热搅拌的温度为60℃～80℃；搅拌时间为10h～12h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中产物i粗产物、naoh溶液、纯水的体积比为3：5：3；
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中加热搅拌温度为60℃～80℃；搅拌时间为1h～2h。
8.一种甲萘醌人工抗原，其特征在于，所述甲萘醌人工抗原由权利要求1所述的甲萘醌半抗原与大分子载体蛋白偶联得到；
9.权利要求8所述的甲萘醌人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.一种甲萘醌人工抗原抗血清效果评价方法，其特征在于，由权利要求9所述的甲萘醌半抗原与血蓝蛋白偶联物作为免疫原，所述甲萘醌半抗原与卵清蛋白偶联物作为包被原，进行基于间接竞争酶联免疫分析方法检测，具体步骤如下:
