本发明涉及组织填充材料，具体涉及一种仿生细胞外基质的复合填充剂及其制备方法。
背景技术：
1、目前改善衰老主要是通过注射填充物的方式来补充真皮或皮下组织甚至是骨组织缺失的成分，达到改善面部缺陷，保持年轻化的效果，本质是为皮肤补充细胞外基质。
2、主流的填充材料包括物理占位生物材料(如玻尿酸)、刺激再生材料(如plla童颜针、pcl少女针)、生物活性再生材料(如胶原蛋白、脱细胞真皮基质的多孔再生材料(adm))，但均具有不可避免的缺点。例如玻尿酸填充剂通过物理占位的作用仅能暂时补充容量，透明质酸随着时间逐渐降解，不能维持长久效果；plla等刺激再生材料即时填充效果差，该类材料通过引发炎性反应激发成纤维细胞聚集到微球表面，通过粘附、铺展、增殖等过程分泌细胞外基质(ecm)，产生再生效果的时间很长；而adm、胶原蛋白等生物活性再生材料可刺激生理性再生，却具有维持时间短、免疫原性的风险。
3、现有技术中，公开号为cn 117771436a，专利名称是一种注射用再生丝素蛋白-透明质酸钠凝胶及其制备方法，该发明凝胶中的再生丝素蛋白还可以刺激组织的纤维细胞和胶原蛋白再生，延长了填充剂的效果维持时间，是一种具有创新性的组织再生医疗美容填充材料，但其缺点在于，丝素蛋白没有发生交联作用，只是被包裹在交联产物中，使得整个凝胶容易被快速降解，不能整体上降低凝胶的降解速率。
4、同时，现有注射填充通过直接补充皮肤流失的ecm实现抗衰，填充剂成分单一，难以同时实现原位填充和原位再生的效果。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种可同时实现原位填充和原位再生的复合填充剂，具体提供一种仿生细胞外基质的复合填充剂及其制备方法。该复合填充剂具有更强的抵抗酶解能力和更好的填充塑型效果。
2、为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
3、本发明利用自主研发的新型材料rgd肽修饰的透明质酸钠(经rgd肽修饰的透明质酸钠)是由rgd的氨基端通过引发剂edc作用共价固定在透明质酸钠的羧基端上形成；rgd肽修饰的透明质酸钠中的rgd肽，能与细胞表面的多种整合素(αvβ3，α5β1)受体特异性识别并结合，形成rgd-整合素-细胞骨架跨膜信息系统，增强细胞内多种信号转导，增加细胞的粘附及迁移作用，此作用使更多的细胞富集在注射位点。
4、基于此，本发明提供一种仿生细胞外基质的复合填充剂及其制备方法，选用细胞外基质内主要成分ⅰ型胶原蛋白和经改性的透明质酸构建仿生细胞外基质；首先利用分子量为1.0×106da～1.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠和ⅰ型重组胶原蛋白双重交联形成主体支架，形成二维交联产物，然后与分子量为2.0×106da～2.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠之间进行交联，形成结构更加致密的复合支架，接着与ⅲ型重组胶原蛋白配比复合形成复合填充剂。
5、本发明中复合支架发挥即时填充功能，同时复合支架中的分子量为1.0×106da～1.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠和分子量为2.0×106da～2.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠成分吸引成纤维细胞迁移黏附，ⅰ型胶原蛋白为细胞增殖提供适宜的微环境，促进生理性再生；随着再生支架降解，产生游离透明质酸链和氨基酸等营养物质，同新生胶原等一起补充细胞外基质，持续改善皮肤状态。
6、具体的技术方案如下：
7、所述复合填充剂包括复合凝胶；
8、所述复合凝胶是先由分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠与ⅰ型重组胶原蛋白经两步交联得到二维交联产物；接着，所述二维交联产物与分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠采用bdde作为交联剂交联得到三维交联产物，所述三维交联产物即是所述复合凝胶；
9、所述的两步交联中使用的交联剂选自edc和nhs的混合物和/或戊二醛。
10、进一步的，所述复合填充剂还包括ⅲ型重组胶原蛋白。
11、本发明还提供了所述仿生细胞外基质的复合填充剂的制备方法，包括：
12、二维交联产物的制备：将分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠与ⅰ型重组胶原蛋白混合获得分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠/ⅰ型重组胶原蛋白溶液，接着，在edc和nhs的混合物的作用下交联得到初级交联产物；
13、所述初级交联产物在交联剂戊二醛的作用下交联得到二维交联产物；
14、三维交联产物的制备：
15、所述二维交联产物与分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液混合在交联剂bdde的作用下交联得到三维交联产物，即得复合凝胶；
16、将所述复合凝胶与ⅲ型重组胶原蛋白混合，即得所述仿生细胞外基质的复合填充剂。
17、上述方案进一步的说明，制备所述初级交联产物的交联过程还包括离心步骤；优选地，离心条件是：在2～8℃条件下，10000～15000rpm离心10～30min后，静置10～30min，重复以上循环4～6次。
18、上述方案进一步的说明，所述ⅰ型重组胶原蛋白的分子量是55kda；与所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠混合后，所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠的质量浓度是1～15wt.％，ⅰ型重组胶原蛋白的质量浓度是1～10wt.％；优选地，所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠与ⅰ型重组胶原蛋白之间的重量比为1:1～5:1。
19、上述方案进一步的说明，所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠/ⅰ型重组胶原蛋白与交联剂之间的重量比为100:1～100:10。
20、上述方案进一步的说明，所述的edc和nhs的混合物是edc和nhs溶于水混合后得到的，所述edc与所述nhs的质量比是5:1，优选地，所述edc与所述nhs混合后配制成浓度为20wt.％的交联剂溶液。
21、优选地，所述二维交联产物与戊二醛溶液质量比1:1；所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度是0.2～2wt.％。
22、优选地，所述分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液与所述二维交联产物之间的重量比是1:1。
23、上述方案进一步的说明，所述分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液的配制过程是：在ph>10的碱性溶液中加入bdde，形成0.5～2wt.％的bdde溶液，搅拌均匀后，加入分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠，配制成0.5～2wt.％的分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液。
24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25、1.本发明复合填充剂相较于传统的填充剂，粘弹性得到显著提高，有益于得到更广范围的应用。
26、2.本发明选用细胞外基质内主要成分ⅰ型胶原蛋白和经改性的透明质酸构建仿生细胞外基质，利用分子量为1.0×106da～1.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠和重组ⅰ型胶原蛋白双重交联形成初步的网络支架，然后该初步的网络结构与分子量为2.0×106da～2.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠之间进行交联，形成排布整齐、结构致密的复合支架，最后复合支架与ⅲ型胶原蛋白复配得到仿生细胞外基质的复合填充剂，该制备方法不仅提高了填充剂的粘弹性，更重要的是降低了填充剂的降解速度，使皮肤能够长时间的保持状态。
27、3.本发明提供了一种同时实现原位填充和原位再生的复合填充剂，rgd肽修饰的透明质酸钠/胶原蛋白支架发挥即时原位填充功能，同时rgd肽修饰的透明质酸钠成分吸引成纤维细胞迁移黏附，ⅰ型胶原蛋白为细胞增殖提供适宜的微环境，促进后期的原位生理性再生；随着再生支架降解，产生游离透明质酸链和氨基酸等营养物质，同新生胶原等一起补充细胞外基质，持续改善皮肤状态。
28、4.本发明通过对细胞外基质主要成分(ⅰ型重组胶原蛋白、不同分子量的改性透明质酸)进行三重交联，再与重组ⅲ型人源化胶原蛋白混合构建出一款仿生细胞外基质复合支架；其中胶原蛋白选用无免疫原性风险的重组胶原蛋白，透明质酸选用本公司自主研发的新型改性材料rgd肽修饰的透明质酸钠，相较于普通ha，rgd肽能与细胞表面的多种整合素(αvβ3，α5β1)受体特异性识别并结合，增加细胞的粘附及迁移作用，使更多的细胞富集在注射位点。
29、5.本发明首先利用分子量为1.0×106da～1.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠和重组ⅰ型胶原蛋白初步形成交联网络结构，在交联过程中，并施加离心力使凝胶内部分子链沿着受力方向进行择优取向排列得到有序交联网络；再二次加入交联剂巩固有序网络结构；最后加入分子量为2.0×106da～2.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠，使其高分子长链均匀分布和穿插在已交联的有序网络结构中，再次进行三次交联，得到具有均匀致密交联网状结构的复合支架，使其具有更强抵抗酶解能力和更好的填充塑型效果。
30、6.进一步的，本发明中，分子量为1.0×106da～1.5×106da的rgd肽修饰的透明质酸钠和ⅰ型重组胶原蛋白三重交联形成主体支架，再与ⅲ型重组人源化胶原蛋白混合得到仿生细胞外基质的复合填充剂，rgd肽修饰的透明质酸钠/胶原蛋白支架发挥即时原位填充功能，同时rgd肽修饰的透明质酸钠成分吸引成纤维细胞迁移黏附，ⅰ型重组胶原蛋白及润滑剂中的ⅲ型重组胶原蛋白为细胞增殖提供适宜的微环境，促进原位生理性再生，随着再生支架降解，产生游离透明质酸链和氨基酸等营养物质，同新生胶原等一起补充细胞外基质，持续改善皮肤状态。
1.一种仿生细胞外基质的复合填充剂，其特征在于，所述复合填充剂包括复合凝胶；
2.根据权利要求1所述的仿生细胞外基质的复合填充剂，其特征在于，所述复合填充剂还包括ⅲ型重组胶原蛋白。
3.权利要求1～2任一项所述仿生细胞外基质的复合填充剂的制备方法，包括：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备所述初级交联产物的交联过程还包括离心步骤；优选地，离心条件是：在2～8℃条件下，10000～15000rpm离心10～30min后，静置10～30min，重复以上循环4～6次。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述ⅰ型重组胶原蛋白的分子量是55kda；与所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠混合后，所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠的质量浓度是1～15wt.％，ⅰ型重组胶原蛋白的质量浓度是1～10wt.％；优选地，所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠与ⅰ型重组胶原蛋白之间的重量比为1:1～5:1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分子量为1.0×106da～1.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠/ⅰ型重组胶原蛋白与交联剂之间的重量比为100:1～100:10。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的edc和nhs的混合物是edc和nhs溶于水混合后得到的，所述edc与所述nhs的质量比是5:1，优选地，所述edc与所述nhs混合后配制成浓度为20wt.％的交联剂溶液。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二维交联产物与戊二醛溶液质量比1:1；所述戊二醛溶液中戊二醛的质量浓度是0.2～2wt.％。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液与所述二维交联产物之间的重量比是1:1。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液的配制过程是：在ph>10的碱性溶液中加入bdde，形成0.5～2wt.％的bdde溶液，搅拌均匀后，加入分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠，配制成0.5～2wt.％的分子量为2.0×106da～2.5×106da的经rgd肽修饰的透明质酸钠溶液。
