本发明属于植物检疫，具体涉及一种用于检测茶树坏死环斑病毒的lamp引物组、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、茶树坏死环斑病毒(tea plant necrotic ring blotch virus，tpnrbv)是北岛病毒科(kitaviridae)、蓝莓坏死环斑病毒属(blunevirus)成员。茶树坏死环斑病毒自2018年在中国茶树上首次报道以来，先后在伊朗和日本的茶树上有发生的报道。该病毒粒体为球形，基因组包含4个正单链rna片段，分别为rna1、rna2、rna3和rna4，长度分别为5922nt、4107nt、2678nt和2272nt。茶树坏死环斑病毒的4个rna片段末端均有长度不一的poly(a)结构。rna1的开放阅读框(open reading frame，orf)位于第135-5720核苷酸(nucloetides，nts)位置，编码一个长度为1861个氨基酸的甲基转移酶(methyltransferase，mtr)、类半胱氨酸蛋白酶(cysteine-like protease，c-pro)和解旋酶(helicase,hel)复合体；rna2的orf位于第120-3755nts位置，编码一个长度为1211个氨基酸的解旋酶(hel)和rna依赖的rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase，rdrp)复合体；rna3包含4个orf，分别编码长度为123、250、195和210个氨基酸的未知功能蛋白；rna4的orf位于第384-1331nts位置，编码一个长度为315个氨基酸的运动蛋白(movement protein，mp)。茶树坏死环斑病毒不能有效通过机械接种、种子和无性繁殖材料进行传播，但其可在田间自然条件下传播，具体传播机制尚不明确。茶树坏死环斑病毒在有症状和无症状的茶树顶芽、叶片、根、枝干均能检测到，具有系统性侵染的特点。受茶树坏死环斑病毒侵染的茶树通常表现为叶片边缘褪绿，树枝出现斑驳褪色，成熟叶片出现典型的坏死环斑并导致过早落叶，树体矮化并显著降低新鲜叶片的产量，严重影响茶叶的产量和品质。
2、针对茶树坏死环斑病毒，已报道的检测方法主要为普通rt-pcr和实时荧光定量rt-pcr技术。普通rt-pcr检测茶树坏死环斑病毒具有快速、准确、灵敏的优点，但不足的是检测效率仍相对较低，结果判断需要通过琼脂糖凝胶电泳、紫外观察以及pcr产物测序等步骤，易出现假阴性或假阳性，且耗时相对较长。实时荧光定量rt-pcr技术的灵敏度显著高于普通rt-pcr，检测结果可通过荧光定量pcr仪实时监测和判定，但该技术需要价格昂贵的荧光定量pcr仪，不适合在基层单位使用和推广。因此，亟需建立一种速度快、特异性强、灵敏度高、适于基层单位现场使用的茶树坏死环斑病毒检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是建立一种速度快、特异性强、灵敏度高、适于基层单位现场使用的茶树坏死环斑病毒检测方法。
2、为了实现上述目的，本发明首先提供了用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组。
3、本发明提供的用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组由外引物tpnrbv-f3、外引物tpnrbv-b3、内引物tpnrbv-fip、内引物tpnrbv-bip和环引物tpnrbv-lf组成；
4、所述外引物tpnrbv-f3为序列1所示的单链dna分子；
5、所述外引物tpnrbv-b3为序列2所示的单链dna分子；
6、所述内引物tpnrbv-fip为序列3所示的单链dna分子；
7、所述内引物tpnrbv-bip为序列4所示的单链dna分子；
8、所述环引物tpnrbv-lf为序列5所示的单链dna分子。
9、上述引物组中，所述外引物tpnrbv-f3、所述外引物tpnrbv-b3、所述内引物tpnrbv-fip、所述内引物tpnrbv-bip和所述环引物tpnrbv-lf的摩尔比为1:1:10:10:2。
10、为了实现上述目的，本发明又提供了含有上述引物组的试剂盒，所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
11、a1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒；
12、a2)检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒；
13、a3)区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒。
14、上述试剂盒还可包括rna提取试剂、将rna反转录为cdna的试剂和用于环介导等温扩增的其它试剂。
15、进一步的，所述用于环介导等温扩增的其它试剂包括bst dna聚合酶、缓冲液(如10×isothermal amplification buffer)、dntps(如dntp mix)、mg2+(如mgso4)。
16、再进一步的，所述试剂盒还包括荧光染料(如sybr green i)。
17、更进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照(如不携带茶树坏死环斑病毒的健康茶树样品)和阳性对照(如携带茶树坏死环斑病毒的茶树样品)。
18、为了实现上述目的，本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒的新用途。
19、本发明提供了上述引物组或上述试剂盒在如下a1)-a6)中任一种：
20、a1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒；
21、a2)检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒；
22、a3)区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒；
23、a4)制备鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的产品；
24、a5)制备检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒的产品；
25、a6)制备区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒的产品。
26、为了实现上述目的，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的方法。
27、本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的方法为如下s1)或s2)或s3)：
28、所述s1)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过观察浊度曲线判断待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒：若浊度曲线呈“s”型扩增曲线，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若浊度曲线呈水平直线，则待测病毒为或候选为非茶树坏死环斑病毒；
29、所述s2)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，向反应体系中加入荧光染料(如sybr green i)通过观察反应体系颜色变化判断待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒为或候选为非茶树坏死环斑病毒；
30、所述s3)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过检测反应产物电泳后是否出现梯状条带判断待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒：若反应产物电泳后出现梯状条带，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若反应产物电泳后未出现梯状条带，则待测病毒为或候选为非茶树坏死环斑病毒。
31、为了实现上述目的，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒的方法。
32、本发明提供的检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒的方法为如下t1)或t2)或t3)：
33、所述t1)包括如下步骤：提取待测样品的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过观察浊度曲线判断待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒：若浊度曲线呈“s”型扩增曲线，则待测样品感染或候选感染茶树坏死环斑病毒；若浊度曲线呈水平直线，则待测样品未感染或候选未感染茶树坏死环斑病毒；
34、所述t2)包括如下步骤：提取待测样品的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，向反应体系中加入荧光染料(如sybr green i)通过观察反应体系颜色变化判断待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒：若反应体系呈绿色，则待测样品感染或候选感染茶树坏死环斑病毒；若反应体系呈橙色，则待测样品未感染或候选未感染茶树坏死环斑病毒；
35、所述t3)包括如下步骤：提取待测样品的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过检测反应产物电泳后是否出现梯状条带判断待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒：若反应产物电泳后出现梯状条带，则待测样品感染或候选感染茶树坏死环斑病毒；若反应产物电泳后未出现梯状条带，则待测样品未感染或候选未感染茶树坏死环斑病毒。
36、为了实现上述目的，本发明还提供了一种区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒的方法。
37、本发明提供的区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒的方法为如下u1)或u2)或u3)：
38、所述u1)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过观察浊度曲线判断待测病毒为茶树坏死环斑病毒还是其它病毒：若浊度曲线呈“s”型扩增曲线，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若浊度曲线呈水平直线，则待测病毒为或候选为其它病毒；
39、所述u2)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，向反应体系中加入荧光染料(如sybr green i)通过观察反应体系颜色变化判断待测病毒为茶树坏死环斑病毒还是其它病毒：若反应体系呈绿色，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若反应体系呈橙色，则待测病毒为或候选为其它病毒；
40、所述u3)包括如下步骤：提取待测病毒的rna，反转录为cdna，以所述cdna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增反应；完成环介导等温扩增反应后，通过检测反应产物电泳后是否出现梯状条带判断待测病毒为茶树坏死环斑病毒还是其它病毒：若反应产物电泳后出现梯状条带，则待测病毒为或候选为茶树坏死环斑病毒；若反应产物电泳后未出现梯状条带，则待测病毒为或候选为其它病毒。
41、上述任一所述方法中，所述环介导等温扩增反应的体系包括外引物tpnrbv-f3、外引物tpnrbv-b3、内引物tpnrbv-fip、内引物tpnrbv-bip、环引物tpnrbv-lf、bst dna聚合酶、dntps、mg2+。
42、所述外引物tpnrbv-f3、所述外引物tpnrbv-b3、所述内引物tpnrbv-fip、所述内引物tpnrbv-bip和所述环引物tpnrbv-lf在所述环介导等温扩增反应的体系中的摩尔比优选为1:1:10:10:2。
43、所述mg2+在所述环介导等温扩增反应的体系中的终浓度优选为9mm。
44、所述dntps在所述环介导等温扩增反应的体系中的终浓度优选为1.2mm。
45、所述bst dna聚合酶在所述环介导等温扩增反应的体系中的终浓度优选为400u/ml。
46、在本发明的一个优选实施方案中，所述环介导等温扩增反应的体系由5μm外引物tpnrbv-f3 1μl、5μm外引物tpnrbv-b3 1μl、40μm内引物tpnrbv-fip 1.25μl、40μm内引物tpnrbv-bip 1.25μl、10μm环引物tpnrbv-lf 1μl、8000u/ml bst dna聚合酶1.25μl、10×isothermal amplification buffer 2.5μl、10mm dntp mix3μl、100mm mgso4 1.75μl、rnase-free ddh2o 9μl和cdna 2μl组成。
47、在本发明的一个优选实施方案中，所述环介导等温扩增反应的条件为：64℃下恒温反应60min，然后在80℃下恒温处理5min。
48、上述任一所述应用或试剂盒或方法中，所述待测样品可为茶树，具体可为来源于茶树不同组织部位的样本，如茶树的顶芽、叶片、根、枝干等。
49、上述任一所述应用或试剂盒或方法中，所述其它病毒可为如下病毒中的至少一种：茶树潜隐病毒1(camellia cryptic virus 1，ccv1)、油茶双生病毒(oil teaassociated geminivirus，otagv)、葡萄卷叶伴随病毒7号(grapevine leafroll-associated virus 7，glrav-7)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，tmv)。
50、本发明针对茶树坏死环斑病毒基因组序列，选择特异性靶标片段，通过反复设计、筛选出了特异性lamp引物组合，并经反应条件和反应体系的无数次优化，确定了lamp最佳反应条件和反应体系，提供了用于检测茶树坏死环斑病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法。通过实验证明：本发明的茶树坏死环斑病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法能够用于茶树坏死环斑病毒的快速检测，具有仪器设备要求低、检测速度快、特异性强、灵敏度高、结果判定简单和成本低廉的突出优点。
51、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1)实用性好、适用于基层使用：本发明检测方法操作简便，在恒温水浴锅中也可完成，可以无需特殊的仪器设备，且检测结果判定简单，能够通过肉眼直接观察，因此易于在基层推广应用。2)检测时间短、速度快：本发明在60min内即可完成对茶树坏死环斑病毒的检测，lamp扩增效率高，检测时间短、速度快。3)特异性强：lamp检测通过4条特异性引物识别靶标基因的6个区域进行扩增，任意1条引物与靶序列不匹配则无法正常进行反应，可以将茶树坏死环斑病毒(tpnrbv)与茶树潜隐病毒1(ccv1)、油茶双生病毒(otagv)、葡萄卷叶伴随病毒7号(glrav-7)和烟草花叶病毒(tmv)特异性区分，因此具有很强的特异性。4)灵敏度高：本发明检测方法最低可检测稀释到10-3倍的cdna原液，因此具有很高的灵敏度。
1.用于检测茶树坏死环斑病毒的引物组，所述引物组由外引物tpnrbv-f3、外引物tpnrbv-b3、内引物tpnrbv-fip、内引物tpnrbv-bip和环引物tpnrbv-lf组成；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述外引物tpnrbv-f3、所述外引物tpnrbv-b3、所述内引物tpnrbv-fip、所述内引物tpnrbv-bip和所述环引物tpnrbv-lf的摩尔比为1:1:10:10:2。
3.含有权利要求1或2所述引物组的试剂盒，所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括bst dna聚合酶、缓冲液、dntps和mg2+。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光染料。
6.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-5任一所述的试剂盒在如下a1)-a6)中任一种：
7.一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为茶树坏死环斑病毒的方法，为如下s1)或s2)或s3)：
8.一种检测或辅助检测待测样品是否感染茶树坏死环斑病毒的方法，为如下t1)或t2)或t3)：
9.一种区分或辅助区分茶树坏死环斑病毒与其它病毒的方法，为如下u1)或u2)或u3)：
10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的体系包括外引物tpnrbv-f3、外引物tpnrbv-b3、内引物tpnrbv-fip、内引物tpnrbv-bip、环引物tpnrbv-lf、bst dna聚合酶、dntps、mg2+；
