一种PncA优化基因及应用

一种pnca优化基因及应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体是一种pnca优化基因及应用。


背景技术：

2.nad 是参与细胞能量代谢的多种酶的辅助因子，众多证据表明nad 是衰老和衰老相关疾病的重要影响因素。nad 的稳态是生物体衰老的一个关键指标，跨物种的细胞nad 水平普遍存在年龄依赖性下降。已经有多项研究表明：不同nad 前体(na、nr和nmn)对酵母、线虫、果蝇和小鼠寿命和健康存在影响。除此之外，增加细胞内nad 的策略被认为是一些神经退行性疾病的新的潜在治疗干预措施。总之，nad 补充延缓了实验动物模型的正常衰老和衰老相关疾病。
3.随着个体的衰老，体内nad 的浓度是逐渐降低的，一方面的原因是，伴随着衰老过程，机体内dna的损伤加剧，parp-1活性增强，以及cd38活性也随着衰老进程增加，这都导致nad 被消耗增多。而另一个重要原因是，参与nad 合成的酶nampt活性在年老个体中降低，导致nam无法转化为nmn，进而nad 合成量降低。同时，由于nad 被消耗产生底物nam，而nam由于无法被进一步利用，在个体内出现积累。nam除了作为合成nad 的前体外，还是sirts蛋白的抑制剂。虽然nam在哺乳动物中不能被转化为na，但肠道微生物中却存在一类基因pnca可以实现nam的利用，催化其生成na。一方面，肠道微生物利用这个途径来合成自身的nad ，但另一方面，它可以帮助宿主实现nam到na的催化，帮助宿主利用“脱酰胺”来完成nad 的合成，部分弥补由于nampt活性降低而导致的nad 量的减少。
4.nad 在人和人的肠道微生物中的nad 合成消耗代谢如图1所示，在人中有两个主要的途径有助于nad的合成：从头合成和前体的回收合成途径。nad的从头合成途径通过kynurenine途径将色氨酸转化为喹啉酸(qa)，再进一步合成nad 。合成nad 的前体主要有烟酰胺，烟酸，烟酰胺核苷和烟酰胺单核苷酸。在细胞内，nad 消耗酶主要有sirtuins、parps和cd38等，这些酶的底物都包含烟酰胺。在肠道菌群中，nad 的从头合成主要是利用天冬氨酸，而非人类中所使用的色氨酸。尽管两种生物从头合成的物质不一样，但是用来合成nad 所使用的前体物质是一样的，细菌同样是主要利用烟酰胺，烟酸，烟酰胺核苷和烟酰胺单核苷酸等前体。对于同样前体的依赖，必然导致了人类和人类体内的肠道菌群之间在nad 合成代谢上的竞争或是合作。图中标红的线条是在肠道菌群中特有的合成途径，即将烟酰胺转化为烟酸的脱酰胺途径。
5.根据上述分析，现有研究存在以下问题：1、宿主(细胞)中无法实现nam到na的转化；2、在哺乳类动物衰老的过程中，由于nad 被消耗产生底物nam，而nam由于无法被进一步利用，在个体内出现积累。nam除了作为合成nad 的前体外，还是sirts蛋白的抑制剂。因此，降低nam的量是一个关键；3、前尚无很好的办法解决这个问题，都是采用补充nad 前体，比如nmn来解决抗衰老的问题，但是也存在许多问题，还需要进一步研究。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种pnca优化基因及应用，具有重要的意义和临床应用价值。
7.为达此目的，本发明提供如下的技术方案：
8.本发明的第一个方面，提供了一种pnca优化基因，其特征在于，其核苷酸序列包括seq id no.1或其同源性达95％以上的同源序列。
9.seq id no.1：
10.atgccaccccgagccctgctgcttgtggacctgcagaacgacttctgtgcaggaggagcacttgccgtgcccgagggcgactcaacagtggacgtggccaacagactgatcgactggtgccaaagcaggggcgaagccgtgatcgccagccaagactggcacccggcgaaccatggcagcttcgcaagccaacatggcgtggagccgtatacccccggtcaactcgacggtctgccccagaccttctggcccgaccactgcgttcagaacagtgagggcgctcaactccacccgctgctgcaccagaaagccatcgcagctgtgtttcataagggtgagaaccctctggtagatagctacagcgctttcttcgacaacggccgaaggcagaagaccagcctggacgattggctgcgagatcacgagatcgacgagcttatcgtgatgggcctggccaccgactactgcgtgaaattcacggtgctggatgctctgcagttgggctacaaggtgaacgtgataacagacggctgcaggggtgtgaacattcagccccaagacagcgcccacgccttcatggaaatgtctgcggcaggagcaaccctgtacacactggctgactgggaggagacccagggatag
11.本发明提供一种微生物来源的pnca基因，我们通过对其进行改造，让其在哺乳类动物细胞(包括人)中进行表达，它可以通过结合腺相关病毒aav针对不同组织，器官进行过表达，实现nam向na的转变，从而改变体内nam的含量，促进nad 稳态的实现，最终实现抗衰老的应用。
12.本发明的第二个方面，提供了一种含有本发明所述的pnca优化基因的重组表达载体。
13.优选的，所述的pnca优化基因核苷酸序列包括seq id no.1或其同源性达95％以上的同源序列。
14.优选的，所述载体包括哺乳动物组织、器官细胞特异性病毒载体。
15.本发明的第三个方面，提供了一种含有本发明所述的重组载体的宿主细胞。
16.优选的，所述的pnca优化基因核苷酸序列包括seq id no.1或其同源性达95％以上的同源序列。
17.优选的，所述载体包括哺乳动物组织、器官细胞特异性病毒载体。
18.优选的，所述宿主细胞包括肠道菌、哺乳动物组织、器官的细胞。
19.本发明的第四个方面，提供了本发明所述的pnca优化基因在宿主内高表达pnca蛋白的应用。
20.优选的，所述的应用是将所述的pnca优化基因植入载体，携带pnca优化基因的载体在宿主内高表达pnca蛋白。
21.优选的，所述宿主包括哺乳动物，所述载体包括哺乳动物组织、器官细胞特异性病毒载体；进一步优选的，所述哺乳动物组织、器官细胞包括肝脏细胞，特异性病毒包括avv病毒。
22.优选的，宿主内高表达pnca蛋白可提高宿主细胞的nad 水平相较于常规水平不少于5倍。
23.优选的，所述的pnca优化基因核苷酸序列包括seq id no.1或其同源性达95％以
上的同源序列。
24.优选的，宿主细胞实现nam向na的转变，从而改变体内nam的含量，促进nad 稳态的实现，最终实现抗衰老。
25.优选的，nad 水平增加有利于缓解疾病。进一步优选的，所述疾病包括脂肪肝。
26.本发明的第五个方面，提供了本发明所述的pnca优化基因在制备抗衰老的药物中的应用。
27.与现有技术相比，本发明有益效果及显著进步在于：
28.1、本发明提供的pnca优化基因可以在哺乳类细胞、组织中进行表达的，实现nam向na的转变，从而改变体内nam的含量，促进nad 稳态的实现，最终实现抗衰老的应用；
29.2、本发明直接在哺乳类细胞、组织中高表达pnca蛋白，大幅度改变体内nam的含量，对脂肪肝等疾病也有缓解效果。
附图说明
30.为更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的实施例所需使用的附图作一简单介绍。
31.显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明中的部分实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，但这些其他的附图同样属于本发明实施例所需使用的附图之内。
32.图1为现有技术中nad 在人和人的肠道微生物中的nad 合成消耗代谢；
33.图2为本发明实施例1中的pi对具有不同nad 合成途径细菌增殖的影响；
34.图3为本发明实施例2中的pi处理小鼠后肠道微生物的主成分分析图；
35.图4为本发明实施例2中的pi处理小鼠后肠道微生物的种类和多样性的变化；
36.图5为本发明实施例2中的细菌在界中的分布；
37.图6为本发明实施例2中的细菌在物种水平上的分布；
38.图7为本发明实施例2中的由细菌富集的kegg途径；
39.图8为本发明实施例2中的pi处理小鼠后，小鼠肝脏，肠道以及海马体中的nad 变化情况；
40.图9为本发明实施例2中的pnca抑制剂组和对照组肝脏差异表达基因的热图和不同表达基因的kegg分析；
41.图10为本发明实施例2中的pi对293t和hepg2的生长状态和nad 水平的影响结果；
42.图11为本发明实施例3中的通过基因靶向技术构建的pnca敲除大肠杆菌的示意图；
43.图12为本发明实施例3中的大肠杆菌中pnca的敲除效率的验证；
44.图13为本发明实施例3中的pnca在野生型pnca-ko和pnca-oe大肠杆菌中的相对表；
45.图14为本发明实施例3中的细菌上清的代谢组结果中差异代谢物的热图；
46.图15为本发明实施例3中的在小鼠体内定殖不同基因型大肠杆菌后小鼠肝脏nad 水平的变化；
47.图16为本发明实施例3中的利用mcd诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型过程中，小鼠体
重的变化；
48.图17为本发明实施例3中的非酒精脂肪肝模型小鼠在不同基因型的细菌处理后肝脏nad 的变化情况和小鼠肝脏atp的相对含量；
49.图18a为本发明实施例4中的肝脏中pnca在对照组和pnca组的相对表达量；
50.图18b为本发明实施例4中的小鼠肝脏中nad 的相对含量；
51.图18c为本发明实施例4中的小鼠肝脏中atp的相对含；
52.图18d为本发明实施例4中的小鼠肝脏中甘油三酯的含量；
53.图19为本发明实施例4中的小鼠肝脏切片的代表性油红(上)和苏木精和伊红(h&e)(下)染色；
54.图20为本发明实施例4中的pnca和载体组中代谢物的pca和pnca和载体组代谢物的火山图；
55.图21为本发明实施例4中的代谢组结果中在pnca组和vector组中差异明显的代谢物的热图；
56.图22为本发明实施例4中的小鼠肝脏中na，nam，naad和nad 的相对量；
57.图23为本发明实施例4中的不同调控代谢物的富集kegg途径；
58.图24为本发明实施例4中的pnca和载体组之间不同表达基因的热图；
59.图25为本发明实施例4中的rna-seq的kegg富集分析结果；
60.图26为本发明实施例5中的补充mcd饮食后，小鼠体重变化图；
61.图27为本发明实施例5中的正常组合mcd组肝脏的相对nad 水平，伴有pbs，nam和na。
具体实施方式
62.为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例中所提供的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
63.显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
64.对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
65.还需要说明的是，以下的具体实施例可以相互结合，对于其中相同或相似的概念或过程可能在某些实施例中不再赘述。
66.下面，以具体的实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
67.本发明的实验方案均得到同济大学实验动物伦理委员会许可。
68.实施例1pi在体外对细菌生长的影响
69.pnca抑制剂：pyrazinecarbonitrile(pnca inhibitor，pi)，是一种常用于治疗结核病的抗生素pyrazinamide的类似物。pi被报道具有很强的pnca酶活的抑制作用。
70.实验细菌：采用哺乳动物体内的常见菌群，有从头合成途径和脱酰胺合成途径的双歧杆菌、只有从头合成途径的艾克曼氏菌(akk菌)、只有脱酰胺合成途径的唾液乳酸菌。
71.实验方法：对于实验组，在akk菌，长双歧杆菌和唾液乳酸菌的培养基中加入pi，对
照组中，在培养基中加入pbs。在细菌再生长24小时之后，利用酶标仪检测细菌的生长浓度。
72.实验结果：如图2所示，akk菌和长双歧杆菌的生长状况基本不受影响，而依赖脱酰胺合成nad 途径的唾液乳酸菌的生长则处于完全被抑制的状态，这证明pi对脱酰胺途径依赖的细菌来说具有很强的抑制作用。虽然双歧杆菌有pnca基因，但pi对其生长影响不大，说明双歧杆菌主要利用从头合成途径合成nad 。
73.实施例2pi在体内对细菌生长的影响
74.实验方法：
75.2.1、将pi灌胃到小鼠体内；
76.2.2、在实验最后一天(第15天)收集各组小鼠的粪便，后续粪便基因组提取以及测序和数据分析由深圳华大基因科技服务有限公司代做。
77.2.3、解剖小鼠，观察了pi处理后对宿主小鼠肝脏，肠道的nad 水平的影响。利用美国bioassay systems公司的试剂盒enzychrom tm nad /nadh assay kit，并按照试剂盒中的说明书来测量肝脏和肠道的nad 。
78.2.4、采用rna-seq技术分析
79.实验结果：
80.小鼠粪便主成分分析显示不同组小鼠的肠道微生物很好的聚集在一起(图3)，这种组间差异表示pi处理之后对小鼠的肠道微生物产生了显著的影响。用pi处理的小鼠相比对照组小鼠细菌丰富度有显著的提升(图4)。我们推测这种情况出现的原因是pi的处理打破了肠道菌群原有的平衡状态。进一步分析单一菌群丰都，结果如图5-7所示。bacteroidales的丰度显著上升，而clostridiales的丰度明显下降(图5)。在物种水平上，pi处理后显著提高了helicobacter hepaticus，clostridium cocleatum以及bifidobacterium pseudolongum的丰度(图6)。而且pi显著的抑制了肠道菌群的electron transfer，respiration等与nad 密切相关的通路(图7)。这都说明pi对肠道菌群产生了显著的影响。
81.pi处理后对宿主小鼠肝脏、肠道和海马体的影响结果如图8所示，pi降低了宿主肝脏和肠道对烟酰胺的利用效率，使得肝脏和肠道中nad 水平降低。因为pnca的作用是催化烟酰胺到烟酸的转化，由此我们推测在肝脏和肠道中，利用烟酸合成nad 的效率要高于利用烟酰胺的合成途径。也有可能是因为烟酰胺在体内的含量是充足的，因为nad 被消耗之后会生成烟酰胺，额外的补充并不会起到提高nad 合成的作用。此外，pi处理后还降低了海马体中的nad 水平。
82.从rna-seq的结果如图9所示中可以看到，pi处理后影响了肝脏中大量基因的表达，并且显著影响了产生iga的肠免疫网络，以及肝癌发生等生物过程。
83.此外，为了进一步研究pi是通过对肠道菌群的影响，进一步影响了宿主的nad 水平；还是直接对宿主产生的影响。本技术还进行了如下实验：用pi和nr处理了293t和hepg2细胞(在293t和heog2细胞的培养基中分别加入pbs和pi。48小时之后，使用上述提到的nad 检测试剂盒检测细胞nad 水平。)结果如图10所示，pi对细胞的生长状态和nad 水平都没有影响。可见，pi是通过对肠道菌群的影响，进一步影响了宿主的nad 水平，而不是直接对宿主产生的影响。
84.实施例3不同pnca基因型的大肠杆菌影响宿主肝脏nad代谢
85.1、构建了诱导pnca过表达以及敲除pnca基因的两种转基因大肠杆菌。其中通过构建由iptg诱导的pnca表达质粒pet28a-pnca实现pnca的过表达。而pnca基因敲除的大肠杆菌由生工生物工程(上海)股份有限公司代做。如图11所示，采用基因打靶的方式构建了大肠杆菌的pnca基因敲除株。然后，通过pcr验证，pnca基因已经从大肠杆菌基因组上被敲掉(图12)。从pnca基因在三种基因型的大肠杆菌中的表达情况(图13)可以看到，过表达pnca组的大肠杆菌pnca表达量显著高于其余两组。可见，已经成功构件了诱导pnca过表达以及敲除pnca基因的两种转基因大肠杆菌。
86.2、体外实验
87.实验方法：
88.在含有诱导pnca过表达以及敲除pnca基因的两种转基因大肠杆菌的培养基中补充烟酰胺，培养一定时间(24小时)后，将4000g细菌培养液在4℃条件下离心10min后取上清做代谢组检测。
89.实验结果：
90.结果如图14所示，过表达pnca基因的大肠杆菌会释放出更多的烟酸，并且还有过量的nad 在上清中被检测到。
91.3、体内实验
92.实验方法：
93.首先用混合抗生素处理了小鼠5天，减少内源的细菌，再于第6天通过灌胃的方式给小鼠定植两种基因型的大肠杆菌(诱导pnca过表达以及敲除pnca基因的两种转基因大肠杆菌)，并分别设置补充烟酰胺(从第6-20天补充烟酰胺)和不补充烟酰胺的组。第21天，检测不同基因型大肠杆菌对小鼠肝脏nad 的影响。
94.实验结果：
95.结果如图15所示，定植过表达pnca的大肠杆菌组的小鼠可以更高效率的利用烟酰胺来合成nad 。
96.4、过表达pnca的大肠杆菌对小鼠疾病的影响
97.构件疾病小鼠：利用mcd(methionine-holine-deficient)食物构建了小鼠的非酒精性脂肪肝模型。
98.实验结果如图16和17所示，mcd使得小鼠的体重在短时间内快速的下降(图16)，并且肝脏nad 和atp水平也出现明显的降低，在补充过表达pnca的大肠杆菌后，nad 和atp水平都有一定水平的显著提升，但上升的幅度都不是很明显(图17)。结果表明通过补充过表达pnca的大肠杆菌对非酒精性脂肪肝的缓解效果并不是很理想，推测可能是由于通过细菌来提升肝脏nad 的效率不高。
99.实施例4
100.实验步骤：
101.4.1、优化了大肠杆菌pnca的序列信息，使得其可以在哺乳动物体内更高效表达；优化后的序列为：
102.atgccaccccgagccctgctgcttgtggacctgcagaacgacttctgtgcaggaggagcacttgccgtgcccgagggcgactcaacagtggacgtggccaacagactgatcgactggtgccaaagcaggggcgaagccgtgatcgccagccaagactggcacccggcgaaccatggcagcttcgcaagccaacatggcgtggagccgtatacccccggtc
metabolism以及phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis等与脂质代谢相关的通路(图23)。
114.rna-seq分析的结果表明，一些参与脂质代谢的基因发生了显著变化(图24)，并且差异基因富集到的通路包括ppar信号途径，脂肪酸降解等促进脂肪代谢的通路(图25)。出乎我们意料的是，pnca组高表达的基因显著的富集到th1和th2细胞分化通路，说明pnca基因可能在t细胞分化过程中扮演着重要的角色。
115.实施例5
116.实验方法：
117.5.1、用烟酸处理mcd诱导的小鼠，称量并记录小鼠体重；
118.5.2、小鼠肝脏的nad 水平。
119.实验结果：
120.小鼠体重的变化结果如图26所示，到实验后期，pnca组的小鼠体重较为稳定。
121.小鼠肝脏nad 结果如图27所示，可见，烟酸对小鼠肝脏nad 的提升并没有明显的效果。这说明，pnca在细胞内部发挥的作用要远远高于通过直接补充烟酸所发挥的作用。肝脏对外源补充的烟酸吸收效率很低，因此通过直接补充烟酸并不能起到很好的提高nad 水平的效果。
122.综上所述，本发明通过对生物来源的pnca基因进行改造，让其在哺乳类动物细胞(包括人)中进行表达，发现其可以提高受体细胞的nad 水平，利用pnca抑制剂处理中年小鼠可以降低小鼠肝脏、肠道和海马中的nad 水平，进一步通过构建pnca过表达和pnca敲除的大肠杆菌定植到小鼠中以及构建在肝脏中特异性表达pnca的腺相关病毒，我们都观察到了pnca基因对小鼠肝脏nad 合成的显著影响。并且我们通过饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型验证了特异性在肝脏过表达pnca蛋白可以提高肝脏nad 水平，逆转脂肪肝疾病表型。通过将其过表达在各组织、器官，以提高各组织、器官的nad 水平，最终达到抗衰老的目的。因此，本发明显示了其在衰老领域中的潜在应用价值。
123.在上述说明书的描述过程中：
124.术语“本实施例”、“本发明实施例”、“如
……
所示”、“进一步的”、“进一步改进的技术分方案”等的描述，意指该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中；在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例，而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点等可以在任意一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合或组合；此外，在不产生矛盾的前提下，本领域的普通技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合或组合。
125.最后应说明的是：
126.以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非是对其的限制；
127.尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，本领域技术人员根据本说明书内容所做出的非本质改进和调整或者替换，均属本发明所要求保护的范围。