本发明属于牛生物制品和诊断试剂领域，具体涉及到一种具有竞争活性的抗牛白血病病毒gp51蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、牛白血病病毒(bovine leukemia virus，blv)作为牛地方流行性白血病(enzootic bovine leukosis，ebl)的病原，感染后可以导致b细胞淋巴肉瘤，在世界绝大部分地区均有不同程度的流行。ebl的潜伏期较长，一般为3-8年，因而blv的感染容易被低估和忽视。大量数据显示，感染blv在一定程度上会引起免疫失调，导致其他传染病的发病率升高，以及产奶量和生殖效率降低，带来较大的经济损失。感染blv后出现的临床症状包括产奶量减少、浅表淋巴结肿大、消化障碍、食欲减退、跛行、瘫痪等，同时引起的恶心淋巴瘤，能入侵子宫、脾脏、肺、肾等多种器官，从而导致泌尿、呼吸和消化系统疾病。针对blv感染引起的经济损失不只是产奶量减少导致的，还因为一些国家和地区对感染blv的动物实行了严格的进出口管控，这会间接产生经济损失。对于blv的感染，目前尚无有效的治疗药物或预防疫苗，主要防控措施是扑杀或隔离感染牛，所以对于blv的检测在该病的防控和监测中起着重要作用。
2、blv属于反转录病毒科，遗传物质为单链rna，病毒粒子呈球形，有双层膜结构，核衣壳呈正二十面体对称。blv的结构基因分为gag、pol、pro、env，主要负责病毒的感染和复制。这四种结构基因分别负责编码不同的蛋白，其中gag基因负责编码基质蛋白p15、衣壳蛋白p24、核衣壳蛋白p12；env基因负责编码胞外蛋白gp51和跨膜蛋白gp30。目前常用的诊断方法包括血清学抗体检测和前病毒dna检测，其中血清学检测方法主要基于衣壳蛋白p24(宿主免疫反应中的主要目标)和胞膜蛋白gp51(能诱导感染动物产生大量抗体)这两个靶标。报道表明blv人工感染过程中，gp51抗体比p24的抗体出现地更早且滴度更高。目前我国使用的牛白血病血清学检测试剂几乎全部来自国外，其价格昂贵，导致检测成本增加。而目前国内缺乏针对blv感染后检测gp51抗体的商用试剂盒。
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种牛白血病病毒gp51真核重组蛋白。
4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述牛白血病病毒gp51真核重组蛋白在昆虫细胞sf9中表达，其核酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq idno.2所示。
5、本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体。
6、所述抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体通过牛白血病病毒gp51真核重组蛋白作为抗原免疫获得。
7、本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒转染哺乳动物细胞后，表达包含所述的牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
8、本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种受体细胞，其特征在于：所述受体细胞为权利要求3所述的重组质粒的转染细胞。
9、本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体的制备方法。
10、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述将牛白血病病毒gp51序列进行昆虫细胞表达系统密码子优化后构建到pfastbac-hta真核表达供体质粒中，转座至dh10bac感受态细胞，获得相应的穿梭杆粒；
11、将穿梭杆粒转染到sf9昆虫细胞中，得到重组杆状病毒；
12、裂解感染rbv-gp51的sf9细胞，获得真核表达的重组gp51蛋白，通过ni柱对杆状病毒表达的重组蛋白进行纯化；
13、利用纯化的重组gp51蛋白结合弗氏佐剂免疫balb/c小鼠三次，取脾脏与sp2/0细胞融合并通过间接elisa筛选出阳性杂交瘤细胞得到。
14、本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一株稳定分泌抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞3e3，其特征在于：所述杂交瘤细胞3e3保藏编号为cctcc no:c2024192，保藏日期为2024年7月2日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。其与真核表达的重组gp51蛋白和天然构象/变性的gp51蛋白反应，抗体的亚型为igm。
15、本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种杂交瘤细胞3e3在竞争elisa试验检测牛白血病病毒gp51抗体中的应用。
16、作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述在竞争elisa试验检测牛白血病病毒gp51抗体中，以牛白血病病毒gp51真核重组蛋白为包被抗原，杂交瘤细胞3e3培养上清为竞争抗体进行阻断elisa实验。
17、作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述竞争elisa试验检测牛白血病病毒gp51抗体为：包被0.125μg/ml的重组gp51真核表达蛋白于酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗板；每孔200μl 1％bsa 37℃封闭2h；pbst洗板；加入5倍稀释的血清样品50μl37℃孵育1h；加入竞争抗体3e3杂交瘤培养上清50μl 37℃孵育1h，pbst洗板；每孔加入50μl稀释好的goat anti-mouse igm hrp，37℃孵育30min；pbst洗涤；加入100μltmb显色液，室温避光显色10min；使用50μl显色终止液终止显色；使用酶标仪进行读数。
18、作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述读数后，根据od值计算出s/n值，将检测结果s/n值≤0.4915判定为阳性；s/n值≥0.6534判定为阴性，0.4915＜s/n值＜0.6534判定为疑似。
19、本发明有益效果：
20、本发明采用杆状病毒表达系统制备了真核重组gp51蛋白，该系统表达的重组gp51蛋白能够正确折叠和翻译后修饰，并具有生物活性。利用真核重组gp51蛋白作为免疫原免疫小鼠，采用细胞融合技术制备抗gp51蛋白的单克隆抗体。制备的单抗能够用于建立检测gp51抗体的阻断elisa，为blv的诊断提供一种简单、可靠的验证方法。
1.一种牛白血病病毒gp51真核重组蛋白，其特征在于：所述牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的核酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.一种抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体通过牛白血病病毒gp51真核重组蛋白作为抗原免疫获得。
3.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒转染细胞后，表达包含权利要求1所述的牛白血病病毒gp51真核重组蛋白，其核酸序列如seq id no.3所示。
4.一种受体细胞，其特征在于：所述受体细胞为权利要求3所述的重组质粒的转染细胞。
5.如权利要求2所述的抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括：
6.一株稳定分泌抗牛白血病病毒gp51真核重组蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞3e3，其特征在于：所述杂交瘤细胞3e3保藏编号为cctcc no:c2024192，其与真核表达的重组gp51蛋白和天然构象/变性的gp51蛋白反应，抗体的亚型为igm。
7.如权利要求6所述的杂交瘤细胞3e3在竞争elisa试验检测牛白血病病毒gp51抗体中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述在竞争elisa试验检测牛白血病病毒gp51抗体中，以牛白血病病毒gp51真核重组蛋白为包被抗原，杂交瘤细胞3e3培养上清为竞争抗体进行阻断elisa实验。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述竞争elisa试验检测牛白血病病毒gp51抗体为：包被0.125μg/ml的重组gp51真核表达蛋白于酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜；pbst洗板；每孔200μl 1％bsa 37℃封闭2h；pbst洗板；加入5倍稀释的血清样品50μl 37℃孵育1h；加入竞争抗体3e3杂交瘤培养上清50μl 37℃孵育1h，pbst洗板；每孔加入50μl稀释好的goat anti-mouseigm hrp，37℃孵育30min；pbst洗涤；加入100μltmb显色液，室温避光显色10min；使用50μl显色终止液终止显色；使用酶标仪进行读数。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述读数后，根据od值计算出s/n值，将检测结果s/n值≤0.4915判定为阳性；s/n值≥0.6534判定为阴性，0.4915＜s/n值＜0.6534判定为疑似。
