本发明属于涉及生物内的动物疫病诊断技术，具体设计以人工合成马的亨德拉病毒n蛋白基因为材料，构建其原核表达载体，利用复性蛋白为抗原，建立一种诊断马亨德拉抗体的间接elisa检测试剂盒、检测方法及用途。
背景技术：
1、亨德拉病毒(hendravirus,hev)是一种严重的人畜共患病病原。1994年，该病毒在澳大利亚亨德拉镇首次被分离到，亨德拉病毒属于副黏病毒科、副黏病毒亚科中新建立的亨尼帕病毒属。该病毒感染马以后出现发热、精神沉郁、进食减退、心动过速、呼吸困难、面部水肿和共济失调等症状，75％左右病例在48-72小时内死亡。剖检可见病变包括肺泡坏死有纤维蛋白渗出，肺水肿、胸膜下出血、腹腔淋巴结肿大和肺、肾、脑膜等处广泛的血管炎。资料报道显示1994-2013年，共发生58起hev感染事件，均集中于澳大利亚沿海地区，呈散在发生，在我国尚未有该病毒的报道。然而尽管如此，由于目前频繁的国际贸易、马术比赛以及宠物马匹等兴起，因此严格的口岸检疫是防范该病进入我国的重要策略。
2、hev为单股负链rna病毒，编码8种蛋白，其中g蛋白为hev的包膜糖蛋白，通过ephrin b2/3受体结合宿主细胞附着蛋白感染细胞，是感染途径中重要的锚定蛋白；n蛋白为核衣壳蛋白，为主要抗原表位区域，可刺激产生中和抗体。鉴于目前针对马亨德拉病毒g蛋白的亚单位---动物血液---已商品化，也是目前唯一可使用的一种---动物血液---，尽管该---动物血液---在澳大利亚地区的接种率仅为11-17％，但为了与---动物血液---抗体进行区分，本发明针对hev的n蛋白建立elisa检测方法。
3、我国目前口岸对该病的检疫均依赖核酸检测，相关的检测方法(如rt-pcr、荧光定量pcr)和试剂均比较成熟，这种方法对样本中病毒核酸的含量有一定的要求，同时需要较为昂贵的检测仪器及专业的检测人员，最为重要的是，该方法对感染耐过样本不能进行有效检测，同时也不适于大规模样品的筛查和流行病学调查。通过血清中和试验检测抗原对亨尼帕病毒感染的反应仍被视为黄金标准，但是hev活病毒的操作需要在生物安全4级实验室，显然对大批量的口岸检疫是不现实的，而elisa方法是对核酸检测方法的有利补充，利用该方法可以对其抗体水平进行检测，并且其操作方法简单，整个检测流程耗时短，且不需要昂贵的仪器，非常适合大批量的样本检测，检疫过程中核酸和抗体双阴性样本即可视为hev阴性动物。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本发明在成功表达hev-n蛋白的基础上，利用原核表达的融合蛋白作为抗原，建立了一种可用于大规模检测和监测亨德拉抗体的间接elisa方法，为该病的防控提供了一种更便捷的技术手段。该方法可用于马亨德拉病毒感染情况的调查、出入境马匹的检验检疫以及其他涉及马亨德拉病毒抗体滴度检测等方面。
2、本发明的目的在于公开种hev-n蛋白间接elisa检测试剂盒、进一步的公开其检测方法及用途。
3、本发发明的技术内容为：1、优化密码子后hevn蛋白基因的序列；2、hev-n原核表达载体的构建及表达条件；3、间接elisa检测方法的建立。
4、hev-n蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示：veilmevkkggsakgraveiisdignyveetgmagffatirfgletrypalalnefqsdlntikglmllyreigprapymvlleesiqtkfapggypllwsfamgvattidrsmgalningylepmyfrlgqksarhhaggidqnmanklglnsdqvaelaaavqetsvgrqdnnmqareakfaaggvlvgggeqdideeeepiehsgrqsvtfkremsmssladsvpsssvstsggtrltnsllnlsrlaakaikestaqsssernppnnrpqadsgrkddqepkpaqndldfvradv；优化后的核酸序列如seq id no.2所示：gtagaaatactaatggaagttaagaaaggtggcagcgcgaagggccgtgcggtggagatcattagcgacatcggtaactacgttgaggaaaccggcatggcggtttctttgcgaccattcgtttcggtctggagacccgttatccggcgctggcgctgaacgaatttcagagcgatctgaacaccatcaagggcctgatgctgctgtaccgtgaaattggtccgcgtgcgcgtatatggtgctgctggaggaaagcatccaaaccaaatttgcgccgggtggctacccgctgctgtggagctttgcgatgggcgttgcgaccaccatcgaccgtagcatgggcgcgc tgaacattaacgtggttacctggagccgatgtatttccgtctgggtcagaagagcgcgcgtcaccatgcgggtggcattgaccaaaacatggcgaacaaactgggcctgaacagcgatcaggttgcggagctggcggggcggtgcaagaaaccagcgttggtcgtcaggacaacaacatgcaggcgcgtgaagcgaagtttgcggcgggtggcgtgctggttggtggcggtgagcaggacatcgatgaggaagaggaaccgattaacacagcggccgtcaaagcgttacctttaaacgtgaaatgagcatgagcagcctggcggatagcgttccgagcagcagcgttagcaccagcggcggtacccgtctgaccaacagcctgctgaacctcgtagccgtctggcggcgaaggcgattaaagagagcaccgcgcagagcagcagcgaacgtaacccgccgaacaaccgtccgcaagcggacagcggtcgtaaggacgatcaggaaccgaaaccggcgcaaacgacctggattttgtgcgtgcggatgtt。
5、一种hev-n蛋白间接elisa检测试剂盒，包括hevn蛋白，所述hevn蛋白氨基酸序列如seq id no.1所示。
6、进一步的，还包括包被液、酶标板；所述的hev-n蛋白经包被液稀释，包被于酶标板上。
7、更进一步的，还包括封闭剂，所述的封闭剂包括5％脱脂奶粉、3％bsa、1％明胶封闭液和5％猪血清，优选为5％脱脂奶粉，用于hev-n蛋白包被后封闭。
8、进一步的，还包括显色液和终止液。
9、一种hev-n蛋白间接elisa检测试剂方法，包括如下步骤，将hev-n蛋白按照a浓度包被，马血清进行稀释，稀释比例为b，使用封闭剂包被抗原，后于37℃条件下进行封闭，封闭时间为n；酶标二抗分别用tbs进行稀释，加入二抗后37℃孵育的时间m。
10、进一步的，还包括如下步骤，对阳性血清和阴性血清，测定其od450值；计算所测样本的平均值(x)和标准差σ，将“x+3σ”作为临界值；od450值大于或等于临界值判定为阳性，od450值小于临界值判定为阴性。
11、更进一步的，所述的a浓度包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml和10μg/ml，优选为10μg/ml；所述的稀释比例b包括1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，优选为1:800；所述的封闭剂包括5％脱脂奶粉、3％bsa、1％明胶封闭液和5％猪血清，优选为5％脱脂奶粉；所述的封闭时间n包括1、2、3和4h，优选为4h；标二抗分别用tbs进行稀释的稀释倍数包括1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000和1:6000，优选为1：10000；时间m包括30min、40min、60min、80min，优选为30min。
12、所述的hev-n蛋白在制备出入境马匹的检验检疫试剂盒的用途。
13、所述的用途包括检测马亨德拉病毒血清中的抗体。
14、本发明的有益效果：1、可用于口岸马亨德拉病毒抗体的检测，是对核酸检测的有益补充；2、有益于针对马亨德拉抗体开展大规模流行病毒学调查；3、可以对目前马亨德拉---动物血液---和野毒感染所产生的抗体进行有效区分。
1.hev-n蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示：veilmevkkggsakgraveiisdignyveetgmagffatirfgletrypalalnefqsdlntikglmllyreigprapymvlleesiqtkfapggypllwsfamgvattidrsmgalningylepmyfrlgqksarhhaggidqnmanklglnsdqvaelaaavqetsvgrqdnnmqareakfaaggvlvgggeqdideeeepiehsgrqsvtfkremsmssladsvpsssvstsggtrltnsllnlsrlaakaikestaqsssernppnnrpqadsgrkddqepkpaqndldfvradv；优化后的核酸序列如seq id no.2所示：gtagaaatactaatggaagttaagaaaggtggcagcgcgaagggccgtgcggtggagatcattagcgacatcggtaactacgttgaggaaaccggcatggcggtttctttgcgaccattcgtttcggtctggagacccgttatccggcgctggcgctgaacgaatttcagagcgatctgaacaccatcaagggcctgatgctgctgtaccgtgaaattggtccgcgtgcgcgtatatggtgctgctggaggaaagcatccaaaccaaatttgcgccgggtggctacccgctgctgtggagctttgcgatgggcgttgcgaccaccatcgaccgtagcatgggcgcgctgaacattaacgtggttacctggagccgatgtatttccgtctgggtcagaagagcgcgcgtcaccatgcgggtggcattgaccaaaacatggcgaacaaactgggcctgaacagcgatcaggttgcggagctggcggggcggtgcaagaaaccagcgttggtcgtcaggacaac aacatgcaggcgcgtgaagcgaagtttgcggcgggtggc
2.一种hev-n蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于，包括hevn蛋白，所述hevn蛋白氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求2所述的hev-n蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：还包括包被液、酶标板；所述的hev-n蛋白经包被液稀释，包被于酶标板上。
4.如权利要求3所述的hev-n蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：还包括封闭剂，所述的封闭剂包括5％脱脂奶粉、3％bsa、1％明胶封闭液和5％猪血清，优选为5％脱脂奶粉，用于hev-n蛋白包被后封闭。
5.如权利要求3所述的hev-n蛋白间接elisa检测试剂盒，其特征在于：还包括显色液和终止液。
6.一种hev-n蛋白间接elisa检测试剂方法，其特征在于：包括如下步骤，将hev-n蛋白按照a浓度包被，马血清进行稀释，稀释比例为b，使用封闭剂包被抗原，后于37℃条件下进行封闭，封闭时间为n；酶标二抗分别用tbs进行稀释，加入二抗后37℃孵育的时间m。
7.如权利要求6所述的hev-n蛋白间接elisa检测试剂方法，其特征在于：还包括如下步骤，对阳性血清和阴性血清，测定其od450值；计算所测样本的平均值(x)和标准差σ，将“x+3σ”作为临界值；od450值大于或等于临界值判定为阳性，od450值小于临界值判定为阴性。
8.如权利要求6所述的hev-n蛋白间接elisa检测试剂方法，其特征在于：所述的a浓度包括1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml和10μg/ml，优选为10μg/ml；所述的稀释比例b包括1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，优选为1:800；所述的封闭剂包括5％脱脂奶粉、3％bsa、1％明胶封闭液和5％猪血清，优选为5％脱脂奶粉；所述的封闭时间n包括1、2、3和4h，优选为4h；标二抗分别用tbs进行稀释的稀释倍数包括1:2000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000和1:6000，优选为1：10000；时间m包括30min、40min、60min、80min，优选为30min。
9.如权利要求1所述的hev-n蛋白在制备出入境马匹的检验检疫试剂盒的用途。
10.如权利要求9所述应用，其特征子在于：所述的用途包括检测马亨德拉病毒血清中的抗体。
