本发明属于中药检测，具体涉及一种三味红汤散中多成分含量测定方法。
背景技术：
1、三味红汤散，藏药名为玛保松汤，处方出自《四部医典》，由藏紫草、藏茜草、紫草茸三味药材组成，具有清肺止咳，止血化痰，愈疮的作用，用于“洛彩”病，肺炎，肺脓肿，肺结核等引起的咳嗽、咳脓血痰等，藏医临床使用有1200余年的历史，疗效确切。现代研究表明方中藏紫草、藏茜草、紫草茸均不含毒性成分，安全性较高，且均具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒的作用，因此，将三味红汤散开发为治疗结核病的藏药经典名方新药具有重要的临床价值。
2、三味红汤散在《部颁药品标准》中只规定了性状、以及参照2015年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)通则的散剂检查，没有含量测定项，质量控制水平较低，产品临床疗效无法得到保障，限制了该产品的临床推广。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种三味红汤散中多成分含量测定方法。
2、为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
3、本发明所述的三味红汤散为藏紫草、藏茜草、紫草茸药材细粉按重量比30：30:26混合制备成的散剂。三味红汤散中富含萘醌类和蒽醌类物质，其中藏紫草主要有效成分为紫草素、乙酰紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素，藏茜草主要有效成分为羟基茜草素、大叶茜草素、甲基异茜草素，紫草茸主要有效成分为紫胶红色素、紫胶桐酸。
4、本发明所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，采用了高效液相色谱法同时测定了三味红汤散中主要有效成分乙酰紫草素、大叶茜草素的含量。
5、本发明所述的高效液相色谱法采用的色谱柱为c18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），该色谱柱是碳十八硅烷化学键合硅胶固定相的反相色谱柱，其硅胶颗粒粒径为5 μm，柱长为250 mm，柱内径为4.6 mm。
6、本发明所述的高效液相色谱法采用的检测器为紫外检测器，对乙酰紫草素、大叶茜草素的对照品溶液以及混合对照品溶液分别紫外全波长扫描，结果显示对照品溶液和混合对照品溶液在271nm均有较大吸收，因此选择271 nm作为检测波长。
7、本发明考察了甲醇、乙腈作为有机相和不同浓度的磷酸、甲酸溶液作为水相时对乙酰紫草素和大叶茜草峰形和响应的影响，结果显示，当乙腈作为有机相时，两种指标成分的的色谱峰响应明显优于甲醇，当流动相为乙腈：0.2%甲酸水（7：3 , v/v）时，两个成分的色谱峰的分离度、理论塔板数最佳。流速1.0ml·min-1，等度洗脱40min，柱温30℃，进样量10μl。
8、本发明所述高效液相色谱法的供试品溶液制备方法为：将三味红汤散和石油醚按照重量体积比1：5~25加入到提取容器中，称定重量，采用功率250 w、频率40 khz的超声装置，超声提取10~60分钟，放冷，再称定重量，用石油醚补足减失的重量，滤过，滤液蒸干后用甲醇溶解并转移定容至5 ml容量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。
9、本发明首先分别考察了石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等不同溶剂作为提取溶剂，结果发现石油醚的提取率大于其他溶剂，且所得色谱图干扰成分更少，基线平稳，但考虑到石油醚沸点低，蒸发后残留在液相色谱仪的管道和阀门中，影响仪器的稳定性，因此最终选择用石油醚超声提取后，滤液蒸干，再用甲醇复溶制备供试品溶液。
10、本发明的所述三味红汤散是传统的生药散剂，由生药材直接打粉后按一定比例混合而成。本发明研究在确定提取溶剂和提取方式的前提下，通过单因素实验比较了提取时间与料液比对供试品溶液中指标成分的影响。结果表明，超声10、20、30、40、50、60 min，供试品溶液中指标成分含量在30 min时最高，故选择超声30 min；在同等条件下，提取溶剂的用量与供试品溶液中指标成分含量在一定范围内呈正相关，当料液比为1:15、1:20、1:25时，供试品中溶液中指标成分含量变化不显著，因此选择料液比1:15。
11、本发明所述的高效液相色谱法还包括对照品溶液的制备方法，其方法为：首先精密称定对照品乙酰紫草素、大叶茜草素，分别加入甲醇溶解，摇匀，制备得乙酰紫草素、大叶茜草素对照品储备液。然后再将乙酰紫草素、大叶茜草素对照品贮备液按照体积比为5:1进行混合，用甲醇稀释定容，即得到乙酰紫草素、大叶茜草素的混合对照品溶液。
12、本发明所述的高效液相色谱法还包括空白溶液的制备方法，其方法为：不加药材细粉，其余操作同供试品溶液的制备方法，制得空白溶液。
13、本发明所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，采用了紫外检测法测定了三味红汤散中主要有效成分紫胶红色素的含量。
14、本发明所述的紫外检测法，对紫胶红色素的对照品溶液以及混合对照品溶液分别紫外全波长扫描，结果显示对照品溶液在486nm有最大吸收，样品溶液在491nm有最大吸收且在486nm有较大吸收，因此选择486 nm作为检测波长。
15、本发明所述的紫外检测法，考察了水和乙醇两种提取溶剂，发现紫胶红色素在乙醇和水中均可溶解，紫胶黄色素溶于乙醇但不溶于水，因此选择水为溶剂超声提取紫胶红色素。
16、本发明所述紫外检测法的供试品溶液制备方法为：将三味红汤散与超纯水按照重量体积比1:20加入到提取容器中，称定质量，采用功率250 w、频率40 khz的超声装置，超声提取40min，放冷，再次称定质量，用超纯水补足减失的重量，滤过，滤液用超纯水稀释10倍，得供试品溶液。
17、本发明研究在确定提取溶剂和提取方式的前提下，通过单因素实验比较了提取时间与料液比对供试品溶液中指标成分的影响。结果表明，超声10、20、30、40、50、60 min，供试品溶液中指标成分含量在超声10~40 min范围内逐渐增高，40 min以后指标成分含量变化不显著；在同等条件下，提取溶剂的用量与供试品溶液中指标成分含量在一定范围内呈正相关，当料液比为1:20、1:25时，供试品中溶液中指标成分含量变化不显著，因此选择料液比1:20。
18、本发明的有益效果：
19、（1）本发明建立了高效液相色谱法同时对三味红汤散中的指标成分乙酰紫草素、大叶茜草素进行定量测定研究，紫外检测法对三味红汤散中的指标成分紫胶红色素进行定量测定研究，并通过方法学验证，结果表明方法科学、可行；
20、（2）本发明相较于单独分析，可有效减少仪器的进样次数和分析时间，检测时间短，检测结果准确，简单易行；
21、（3）本发明的线性范围广，重复性良好，样品处理的方法稳定可行，所得供试品溶液在常温状态下具有良好的稳定性；
22、（4）本发明的方法稳定准确，可用于三味红汤散的质量评价，可为三味红汤散的质量标准的提升提供参考。
1.三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，采用高效液相色谱法同时测定三味红汤散中乙酰紫草素、大叶茜草素的含量，采用紫外检测法测定三味红汤散中主要有效成分紫胶红色素的含量。
2.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱条件为：c18液相色谱柱；流动相：乙腈-0.2%甲酸水（7：3 , v/v）；等度洗脱40min；检测波长为271nm。
3.根据权利要求2所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，色谱条件的柱温为30℃。
4.根据权利要求2所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，色谱条件的流速为1.0ml·min-1。
5.根据权利要求2所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，c18液相色谱柱是碳十八硅烷化学键合硅胶固定相的反相色谱柱，其硅胶颗粒粒径为5 μm，柱长为250mm，柱内径为4.6 mm。
6.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中供试品溶液制备：将三味红汤散和石油醚按照重量体积比1：5~25加入到提取容器中，称定重量，采用功率250 w、频率40 khz的超声装置，超声提取10~60分钟，放冷，再称定重量，用石油醚补足减失的重量，滤过，滤液蒸干后用甲醇溶解并转移定容至5 ml容量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。
7.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中对照品溶液制备：精密称取乙酰紫草素、大叶茜草素对照品，分别用甲醇溶解并定容，摇匀，制得乙酰紫草素、大叶茜草素对照品储备液。将前述对照品储备液混合，用甲醇定容，得混合对照品溶液。
8.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中进样量10μl。
9.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述紫外检测法最大吸收波长为486nm。
10.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述紫外检测法还包括：
11.根据权利要求1所述的三味红汤散中多成分含量测定方法，其特征在于，所述三味红汤散藏紫草、藏茜草、紫草茸药材按重量比30：30：26组成的药物组合物，或所述药物组合物与药用载体制成的制剂。
