本发明涉及一种烟叶细胞壁结构成分的成像方法，属于细胞壁结构成分分析。
背景技术：
1、植物细胞壁具有很多重要功能，包括控制细胞体积和决定细胞形状，传导水分和养分，以及防御生物和非生物胁迫等，它对植物生长、发育、维持和繁殖以及植物的经济用途很重要。植物细胞壁是由多糖和其他多聚物通过共价键和非共价键连接形成的一种有序的网络结构，它的结构成分主要包括纤维素、果胶、木质素和结构蛋白等物质。细胞壁是植物中最不为人所知的细胞结构，在微观层面研究叶片细胞壁主要结构成分的时空变化，对于理解植物生长和衰老过程具有重要意义。烟草在此被选作模式植物研究上述问题，它是一种茄科烟草属草本植物，除了作为卷烟工业的原材料外，其地上部分在传统草药中被用作杀虫剂、镇静剂、解表药、麻醉剂和驱虫药。
2、细胞壁的结构成分在细胞生长过程中有很大变化，一般来说，纤维素和果胶分别约占初生壁干重的25％和35％。纤维素是由叠加在一起的维纤丝(由(1,4)-β-d-葡聚糖组成的直链结构)组成的。纤维素纤维丝因相邻葡聚糖之间的大量非共价键而具有高硬度、化学性质稳定和不易溶解等结构特性，是植物细胞壁的承重聚合物。果胶是大多数初级细胞壁中最丰富的成分，由多糖组成的异质群体，含有酸性糖(如半乳糖醛酸)和中性糖(如鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖)，这些不同的多糖通常(但并非总是)彼此共价连接形成大的分子结构。果胶在高尔基体中合成时，许多酸性残基被甲基、乙酰基等基团酯化。果胶一旦被分泌到细胞壁中，酯基就会被细胞壁中的果胶酯酶去除，这样羧基上的电荷就暴露出来，增强了果胶形成一个刚性凝胶态的能力。根据酯化的程度，果胶可分为低甲氧基果胶和高甲氧基果胶。果胶作为水合凝胶物质填充于纤维素-半纤维素网状结构中，可防止纤维素网络结构的凝集和塌陷，也决定着细胞壁对大分子的通透性。在真菌对植物组织的入侵过程中，从果胶释放的低聚糖会引起防御反应以限制病原菌的入侵。
3、另外，一些植物(例如烟草)叶片细胞壁中纤维素和果胶含量还与叶片理化性质以及经济价值紧密相关。烟梗占烟叶总质量的20％-30％，其化学物质构成与烟叶基本一致。已有研究表明，在烟叶生长过程中，细胞壁果胶含量逐渐增加；在烟叶衰老(烘烤)过程中，细胞壁中水溶性果胶含量逐渐升高，原果胶含量逐渐降低，总果胶含量呈逐渐下降趋势。然而，上述细胞壁结构成分随生长和衰老过程而发生的微观时空变化尚不够清楚，亟需开发非侵入性、非标记、高通量、原位成像方法。
4、检测纤维素和果胶等细胞壁结构成分的经典分析方法，包括比色法、色谱法、核磁共振法等，主要是用于定量分析且需破坏性溶解。对于在细胞水平的成像任务，常见技术包括质谱成像、荧光成像和拉曼显微成像等，这些技术各有特色，可满足科研人员对不同层次、不同尺度生命现象的观测需求。质谱成像具有高通量能力但空间分辨率不够高，荧光成像技术的灵敏度很高但通常需要进行荧光标记。拉曼显微成像技术具有非标记、高通量、化学物质的指纹特征强、空间分辨率高达微米水平、无损和原位成像等特点，可生成高空间分辨率(＜0.5μm，可达单细胞甚至细胞壁水平)的分子指纹光谱。拉曼显微成像技术在植物细胞壁结构成分的成像研究方面具有独特优势，已被用于研究苹果成熟和采收后储存过程中的变软机理、采后枇杷果实细胞的微观变化、杨树细胞壁成分的可视化、茶树叶片感染枯萎病过程中细胞层面的物质变化、梨感染链格孢病菌过程中细胞壁主要成分的时空变化、苹果感染葡萄座腔菌过程中纤维素、低甲氧基果胶、高甲氧基果胶、木质素和酚类物质在角质层和细胞壁上的时空变化等。
5、当前，对于拉曼成像数据，传统上一般使用夹峰法(integrated intensityfilter)分析成像数据，即选定某个物质的某个特征峰，以该区间的信号强度积分值绘制该物质的分子成像图。然而，若该区间还有其他干扰物质的信号贡献(这在复杂的生物体系中常发生)，夹峰法会有较大误差，甚至可能会导致对潜在生物化学分子的错误解释。
6、植物细胞壁中的纤维素和果胶具有一些特征谱带，表1给出了植物细胞壁多糖的拉曼谱带归属。由于构成多糖的单体的结构相似性，不同多糖的一些拉曼谱带源于相同官能团的振动，从而导致这些拉曼谱带重叠在一起，相互构成光谱干扰。例如，1122和1097cm-1处的谱带通常被分配给纤维素，这归因于纤维素糖苷键中c-o-c的不对称和对称拉伸振动，但是半纤维素的拉曼光谱中也会出现这些谱带(虽然比较微弱)。纤维素中h-c-c、h-c＝o和h-o＝c的弯曲振动是1379cm-1谱带出现的原因，在375cm-1处与环变形模式相关的谱带是纤维素的特征谱带。植物细胞壁中存在甲基化程度不同的果胶。果胶最独特的拉曼谱带出现在836cm-1，源于hmp中α-糖苷键的振动，对ο-乙酰化非常敏感；856cm-1被分配给lmp的α-异构体的c-o-c骨架模式。两种类型的果胶的特征谱带在烟叶细胞壁的拉曼光谱中都有出现。植物细胞壁中其他多糖一般不会干扰果胶的上述特征谱带。酯羰基c＝o伸缩振动谱带(约1742cm-1)是hmp的特征谱带，理论上可用于将其与lmp区分开，然而半纤维素在此会构成光谱干扰，故1742cm-1谱带不宜用于鉴别hmp。
7、表1基于文献对植物细胞壁多糖的拉曼谱带归属
8、
9、基于上述，可知采用拉曼成像数据来分析细胞壁结构成分，拉曼信号面临荧光干扰强(其受到复杂生物样本中的光谱干扰)和信噪比低的限制，导致其不能精准地分析细胞壁结构成分。有必要对此进行研究改进。
技术实现思路
1、基于上述，本发明提供一种烟叶细胞壁结构成分的成像方法，以克服现有技术的不足。
2、本发明的技术方案是：一种烟叶细胞壁结构成分的成像方法，包括：
3、s1通过共聚焦拉曼显微成像仪测量冷冻切片样本，获得原始成像数据立方体tx×y×j；
4、s2s2将原始成像数据立方体展开成列向拓展像素光谱矩阵mxy×j，对列向拓展像素光谱矩阵中每个拉曼成像数据进行预处理；
5、s3从列向拓展像素光谱矩阵中选取待分析物的指纹区间得到数据矩阵并构建mcr-als模型，分解得到列向拓展相对强度轮廓矩阵cxy×n和归一化光谱矩阵sj×n；
6、s4基于待分析物的标准光谱及其特征谱带归属分析，将列向拓展相对强度轮廓矩阵cxy×n和归一化光谱矩阵sj×n中光谱对应的组分分辨为待分析物和干扰组分，并将列向拓展相对强度轮廓矩阵cxy×n中待分析物对应的列重新折叠为矩阵，并以其绘制待分析物的浓度分布成像图。
7、优选的，步骤s1中，所述共聚焦拉曼显微成像仪使用的是50×可见显微物镜，na＝0.75，使用空气冷却的背照式光源ccd检测拉曼信号，采用λ＝532nm的线偏振激光器产生入射光，输出功率为10mw，光栅被设置为600g mm-1，曝光时间设置为3s，在每次开机测量之前，使用峰值在520.70cm-1的硅片校准系统。
8、优选的，步骤s2中，所述预处理包括：
9、s21去除拉曼光谱的宇宙射线引起的尖峰；
10、s22通过mpls算法去除背景；
11、s23通过离散小波变换对每条像素点光谱进行相关区间降噪；
12、s24通过离散傅里叶变换对每个光谱进行软平滑。
13、优选的，步骤s23包括：
14、s231确定拉曼光谱不同水平的噪音区间；
15、s232利用daubechies 2小波进行离散小波变换；
16、s233对每一层的小波细节系数采用硬阈值准则进行处理；
17、s234利用近似系数和修正的细节系数重构去噪后的信号。
18、优选的，步骤s24包括：
19、s241用一系列正弦和余弦组成的傅里叶级数表示光谱，时域的光谱被变换成频域的振幅光谱；
20、s242使用窗口函数消除含噪频率的幅值；
21、s243信号经过离散傅里叶逆变换从频域回到时域，即得到平滑后的光谱。
22、优选的，在步骤s3中，mcr-als模型的构建及分解方法为：
23、s31模型初始化
24、使用奇异值分解算法初始化模型，设定组分数；
25、s32迭代过程
26、在每次迭代中，对浓度轮廓使用非负约束；
27、对光谱轮廓除以总和范数；
28、算法在迭代设定次数后收敛；
29、s33结果矩阵
30、分解出列向拓展相对强度轮廓矩阵cxy×n和归一化光谱矩阵sj×n。
31、优选的，所述待分析物包括纤维素、果胶、木质素和结构蛋白。
32、优选的，所述纤维素的指纹区间为200-450cm-1，所述果胶的指纹区间为800-900cm-1。
33、本发明的有益效果：
34、1、基于非标记拉曼显微成像结合多元曲线分辨-交替最小二乘(mcr-als)模型的方法，显著提高了对复杂生物样品中纤维素和果胶等多糖成分的定量和定性分析能力，为研究植物生长、发育和衰老过程中的细胞壁成分变化提供了一种高效、准确和无损的技术手段。
35、2、本发明使用共聚焦拉曼显微成像技术，能够提供高空间分辨率的成像，甚至达到单细胞或细胞壁水平，对于观察和分析细胞壁成分的微观分布和变化至关重要。同时，拉曼显微成像技术不需要荧光标记，因此避免了标记物对样品的潜在干扰和破坏，保留了样品的天然状态，适用于对敏感生物样品的分析。此外，拉曼光谱提供丰富的化学指纹信息，可以准确鉴定和区分不同的化学成分，如纤维素和不同类型的果胶(高甲氧基果胶和低甲氧基果胶)。
36、3、本发明使用mcr-als模型能够从复杂的拉曼光谱数据中分离出各成分的纯光谱，剔除干扰信号，提高分析的准确性和可靠性。尤其通过拉曼光谱的定性分析和mcr-als模型的定量分辨，能够精确测定纤维素和果胶在细胞壁中的浓度分布，为研究其在植物生长和衰老过程中的动态变化提供重要数据支持。
37、4、本发明基于拉曼共聚焦显微成像技术结合多元曲线分辨-交替最小二乘算法建立了烟叶细胞壁中纤维素、高甲氧基果胶和低甲氧基果胶的成像分析方法，可表征模式植物烟草生长和衰老(烘烤)过程中叶片细胞壁中纤维素和果胶的微观时空变化。所提的成像方法具有非标记、高通量和高特异性的优点。
1.一种烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，步骤
3.根据权利要求1所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，步骤
4.根据权利要求3所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，步骤
5.根据权利要求3所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，步骤
6.根据权利要求1所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，在步骤s3中，mcr-als模型的构建及分解方法为：
7.根据权利要求1所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，所述待分析物包括纤维素、果胶、木质素和结构蛋白。
8.根据权利要求7所述的烟叶细胞壁结构成分的成像方法，其特征在于，所述纤维素的指纹区间为200–450cm-1，所述果胶的指纹区间为800–900cm-1。
