本发明涉及生物传感器设计，尤其涉及一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法。
背景技术：
1、长棘海星(cots)的反复暴发是导致印度-太平洋地区珊瑚礁危机的主要原因之一。了解灾害暴发的时间和地点对于揭示长棘海星暴发机理至关重要，有助于制定有效的预防、干预和管理策略。目前，传统监测方法不仅耗时费力，而且精度不高，难以及时发现暴发初期，无法及时干预。因此，开发高效、精准的长棘海星监测技术对于实现早期预警至关重要。环境dna(edna)方法作为一种精确且高效的生物监测新技术，在海洋物种监测方面展现出巨大潜力，被认为是生态学领域近年来最重要的技术进步之一。据此，uthicke等人利用edna结合数字液滴pcr(ddpcr)技术实现了低密度cots种群的检测[1]，而yan等人通过edna结合实时定量pcr技术分析了西沙群岛礁区cots的种群分布。然而，这些技术依赖于大型仪器和专业训练的人员，且edna的稳定性易受外部因素影响，难以长期保存和运输。因此，针对cots edna的检测，开发一种现场、低成本且快速的方法对于提高监测效率和精度尤为重要。
2、电化学生物传感器，以其高灵敏度、低成本、简易操作、便携性及易于小型化的优势，在生物和环境检测等领域展现出巨大潜力。例如，wang等人利用电化学生物传感器成功实现了低密度cots的检测，但该技术在cots edna检测中受到海水稀释效应影响，导致edna浓度水平降低，限制了其广泛应用。wei等人开发的基于级联放大策略的电化学生物传感器成功实现了长棘海星edna的现场检测，并展现出在灾害暴发前对幼体进行动态监测的巨大潜力，为长棘海星暴发预警提供了有力的工具[3]。然而，该传感器仍存在一些不足，包括额外的dna扩增步骤增加了检测时间和复杂性，一维线性捕获探针降低了杂交效率以及商业化电极芯片的高成本等。因此，开发准确、高效和低成本的电化学生物传感器仍是长棘海星edna的快速现场动态监测的研究重点。
3、近年来，基于酶催化信号放大的电化学生物传感器获得了广泛关注。辣根过氧化物酶(hrp)是一种经典的第三类植物过氧化物酶，它能够催化过氧化物的还原以及多种有机和无机化合物的氧化。由于hrp出色的催化特性、稳定性和多功能性，基于hrp酶催化的三明治型电化学生物传感器已成为研究的热点。这类传感器通常整合了纳米材料、生物识别探针和hrp酶，已证明能显著提高电化学分析性能。生物识别探针的自组装单层(sam)的空间排列对传感器的性能起着关键作用。通过调节dna探针的界面状态，可以优化电极表面探针的构象、密度和空间位阻，从而实现信号的有效放大。为了确保传感性能，选用的纳米材料支架需要具备高比表面积、良好的生物相容性、简单的制备过程及易于功能化的特点。例如，碳材料由于其优异的导电性、高比表面积和良好的生物相容性，成为构建生物传感器并实现信号放大的理想选择。特别是自支撑电极(sse)材料，其独特的结构和组分协同作用，不仅提供了优异的导电性和反应物的易扩散性，还防止了粉末脱落，为生物探针提供了更大的表面积和导电平台，是理想的生物电极选择。
4、电化学生物传感器具有高灵敏度、低成本、简易操作、便携性及易于小型化的优势，在生物和环境检测等领域展现出巨大潜力。例如，wang等人利用电化学生物传感器成功实现了低密度cots的检测，但该技术在cots edna检测中受到海水稀释效应影响，导致edna浓度水平降低，限制了其广泛应用。wei等人开发的基于级联放大策略的电化学生物传感器成功实现了长棘海星edna的现场检测，并展现出在灾害暴发前对幼体进行动态监测的巨大潜力，为长棘海星暴发预警提供了有力的工具。然而，该传感器仍存在一些不足，包括额外的dna扩增步骤增加了检测时间和复杂性，一维线性捕获探针降低了杂交效率以及商业化电极芯片的高成本等。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法，解决传统单探针策略灵敏度低、特异性差，难以满足现场痕量检测，以及dna扩增策略引起的构建繁琐，耗时长的技术问题。
2、开发了一种基于多重信号放大策略，即纳米电极材料，dna自组装单层，hrp酶组装的便携式电化学生物传感器。aunps/mmc sse电极材料通过硬模板法结合煅烧技术制备，具有高比表面积、分级互连的多孔结构以及优异的生物相容性，为生物探针的固定提供了稳定的基底；自组装单层(由ploya捕获探针与mch形成)有效调控探针的表面密度和构象，促进了目标dna的高效以及引入hrp酶催化信号放大策略，显著提升了传感器的检测性能，提高了传感器的检测灵敏度。该传感器得益于多重信号放大策略和优异的电极再生性，显著降低了检测时间和成本。因此，这种新型的便携式生物传感器为快速、现场和低成本检测长棘海星edna提供了新方法，为长棘海星灾害的快速预警及海洋生态系统的保护提供了一种新的技术手段。
3、集成了连续腺嘌呤(polya)自组装单层(sam)探针与3d aunps macro-/mesoporous carbon(aunps/mmc)自支撑电极(sse)，用于长棘海星edna的超灵敏检测。通过硬模板法结合煅烧工艺制备的aunps/mmc sse具有较大的比表面积、较宽的孔径分布和良好的结构稳定性，这些特性有利于dna探针的固定和捕获。此外，相互交联的碳框架结构可加速电子的转移速率，从而实现信号的有效放大。同时，polya sam的构建不仅有利于目标分子的捕获，还能增强hrp酶催化信号放大效果，显著提升电化学信号。该传感器不仅显示出低检测限、高特异性和良好的重现性，还在室内养殖实验中通过与ddpcr的比较，来验证结果的可靠性和准确性。本工作为现场快速、低成本、准确检测长棘海星edna提供了新思路，为长棘海星暴发现场预警提供了有效工具。
4、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5、一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法，所述方法包括如下步骤：
6、步骤1：aunps/mmc sse的制备；
7、步骤2：进行探针设计；
8、步骤3：电化学传感器的构建；
9、步骤4：进行电化学测试，完成设计。
10、进一步地，步骤1的具体过程为：
11、制备二氧化硅模板，将1ml正硅酸四乙酯加入到50ml乙醇、1ml去离子水和5ml氨水的混合溶液中，在室温下连续搅拌6小时，离心分离收集所得产物，并用乙醇和去离子水清洗3次以除去未反应的试剂，最后，将二氧化硅在真空干燥机中60℃干燥以供进一步使用，称取500mg二氧化硅充分碾磨，然后分散于25ml乙二醇中，超声30分钟室温搅拌12小时使二氧化硅均匀分散在溶液中，然后，将悬浮液倒入6cm玻璃培养皿中，置于60℃烘箱中直至完全干燥，得到二氧化硅蛋白石模板；
12、制备mmc sse，利用锡纸按照统一规格制作模具的杯子，将二氧化硅蛋白石模板平铺在杯子底部，将25mg草酸和1ml糠醇混合均匀后，倒入锡纸杯中，使其渗透到二氧化硅蛋白石模板的间隙中，然后，在90℃烘箱中陈化72小时，得到黑色块状材料，将得到的块状材料在氩气中以10℃/min的升温速率加热至200℃保持3小时，然后继续升温至900℃保持3小时，最后，将退火产物置于6m氢氧化钠溶液中浸泡72小时以除去二氧化硅模板，用大量去离子水冲洗后干燥得到mmc sse；
13、制备aunps/mmc sse，首先，利用支架将sse置于烧杯中部，加入40ml去离子完全浸没sse得到混溶液，然后，在搅拌下将1ml 0.01m四氯金酸和1ml谷胱甘肽滴入混溶液中，搅拌10分钟，然后，将1ml 0.1m硼氢化钠加入到混溶液中并在室温下搅拌30分钟。最后，用去离子水反复冲洗sse，并在真空干燥箱中60℃干燥获得aunps/mmc sse。
14、进一步地，步骤3中：电化学测试均使用三电极体系进行，aunps/mmc sse作为工作电极，铂片电极作为对电极，ag/agcl作为参比电极，首先，将aunps/mmc sse浸入0.1μmpolya-cp溶液中孵育过夜，用清洗buffer将sse上未结合的polya-cp冲洗掉，然后，利用0.1mm mch处理电极30分钟，避免非特异性结合并封闭活性位点，随后，利用清洗buffer将未结合的mch冲洗干净，最后，将制备好的工作电极储存在4℃冰箱用于后续dna分析。
15、进一步地，步骤4中：
16、将含有0.1μm的修饰生物素的报告探针与不同浓度的目标dna在杂交buffer中，80℃下混合5分钟，室温冷却20分钟，目标dna与报告探针的充分杂交，然后，将组装好的sse在37℃下浸入杂交溶液中100分钟，用于polya-cp与目标dna充分杂交，最后，将反应后的sse用清洗buffer冲洗后，加入亲和素-hrp室温下孵育20分钟，最后用清洗buffer再次冲洗电极，然后进行电化学检测；
17、采用三电极体系进行电化学测试，工作电极为制备的自支撑电极，将三电极体系搭建完成后，利用便携式电化学工作站在tmb底物溶液中进行cv和i-t测试，cv参数设置为：电位范围为0v至0.8v，扫描速率为0.05v/s，采样间隔为1mv，i-t参数设置为：电压设置为-200mv，扫描速率为30mv/s，记录120s时的稳态电流信号。
18、还包括如下步骤，分别为材料表征、传感器的构建和可行性分析、传感器性能评价和实际样品分析。
19、本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
20、(1)本发明解决传统单探针策略灵敏度低、特异性差，难以满足现场痕量检测，以及dna扩增策略引起的构建繁琐，耗时长等问题，开发了一种基于多重信号放大策略，即纳米电极材料，dna自组装单层，hrp酶组装的便携式电化学生物传感器。aunps/mmc sse电极材料通过硬模板法结合煅烧技术制备，具有高比表面积、分级互连的多孔结构以及优异的生物相容性，为生物探针的固定提供了稳定的基底；自组装单层(由ploya捕获探针与mch形成)有效调控探针的表面密度和构象，促进了目标的高效捕获和快速的电子转移，从而提高了传感器的性能；hrp酶催化信号放大策略，显著提升了传感器的检测。该传感器得益于多重信号放大策略和优异的电极再生性，显著降低了检测时间和成本。因此，这种新型的便携式生物传感器为痕量长棘海星edna的快速现场检测及长棘海星暴发的早期预警提供了新思路。
21、(2)aunps/mmc sse具有高比表面积和分级互连多孔结构，可以为探针的固定，目标的捕获提供更多的活性位点和传质通道，同时加速电子传递和传质过程，从而提高了电化学生物传感器的性能。自组装单层(由ploya捕获探针与mch形成)有效调控探针的表面密度和构象，促进了目标的高效捕获；(iii)hrp酶催化信号放大策略，显著提升了传感器的检测性能；(iv)得益于多重信号放大策略，所制备的便携式电化学生物传感器具有较低的lod(8.8fm)，loq(69.6fm)，以及100fm-1nm的线性范围，优异的电极再生性结合多重信号放大策略，其检测时间和成本都大幅降低，这为痕量长棘海星edna的快速现场检测及长棘海星暴发的早期预警提供了新思路。
1.一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法，其特征在于：步骤1的具体过程为：
3.根据权利要求1所述的一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法，其特征在于：步骤3中：电化学测试均使用三电极体系进行，aunps/mmc sse作为工作电极，铂片电极作为对电极，ag/agcl作为参比电极，首先，将aunps/mmc sse浸入0.1μm polya-cp溶液中孵育过夜，用清洗buffer将sse上未结合的polya-cp冲洗掉，然后，利用0.1mm mch处理电极30分钟，避免非特异性结合并封闭活性位点，随后，利用清洗buffer将未结合的mch冲洗干净，最后，将制备好的工作电极储存在4℃冰箱用于后续dna分析。
4.根据权利要求1所述的一种用于长棘海星快速示踪的电化学生物传感器设计方法，其特征在于：步骤4中：
