前列腺癌相关标志物及其应用的制作方法

苯基乳酸中的至少一种。
16.进一步地，所述前列腺癌相关标志物还包括柠檬酸。
17.进一步地，所述试剂盒还包含样本前处理试剂，所述样本前处理试剂为含0.1～0.3w/v％甲酸的25～35v/v％甲醇水溶液。
18.进一步地，所述样本前处理试剂为含0.1w/v％甲酸的30v/v％甲醇水溶液。
19.本发明通过研究发现前列腺癌患者血清中苹果酸和3-羟基-3-甲基谷氨酸的含量显著高于正常对照，而dl-3-苯基乳酸含量则显著低于正常对照。进一步对检测数据进行roc曲线分析以评价指标的诊断性能，结果表明，苹果酸的auc为0.862，特异性为82.7％，敏感性为 76.3％；3-羟基-3-甲基谷氨酸的auc为0.804，特异性为71.2％，敏感性为84.2％；dl-3-苯基乳酸的auc为0.713，特异性为63.5％，敏感性为73.7％。并且随着肿瘤恶性程度的增加，苹果酸的敏感性为与特异性均为增加。当苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸与dl-3-苯基乳酸联用时，诊断性能进一步提高，auc为0.911，特异性为94.7％，敏感性为76.9％。此外，发明人还发现，将本发明标志物与柠檬酸联合使用能进一步提升所述标志物的诊断性能：当苹果酸与柠檬酸联用时，auc为0.899，特异性为95％，敏感性为85％。上述结果表明，苹果酸、 3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸可作为前列腺癌检测的相关标志物，具有较好的诊断性能，尤其是三者联用时，检测性能更好，诊断准确性很高。本发明提供了一种新的前列腺癌相关生物标志物，其用于前列腺癌诊断时具有样本易得、无创和简便快捷的优点。
附图说明
20.图1为前列腺癌患者组与正常对照者组血清中苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸的z-score结果图。
21.图2为苹果酸在前列腺癌患者组与正常对照者组的含量比较及用于前列腺癌检测的roc 曲线分析结果图，其中，a代表control组，d代表pca组。
22.图3为3-羟基-3-甲基谷氨酸在前列腺癌患者组与正常对照者组的含量比较及用于前列腺癌检测的roc曲线分析结果图，其中，a代表control组，d代表pca组。
23.图4为dl-3-苯基乳酸在前列腺癌患者组与正常对照者组的含量比较及用于前列腺癌检测的roc曲线分析结果图，其中，a代表control组，d代表pca组。
24.图5为苹果酸和柠檬酸联合用于前列腺癌检测的roc曲线分析结果图，其中，a代表 control组，d代表pca组。
25.图6为苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸联合用于前列腺癌检测的roc曲线分析结果图，其中，a代表control组，d代表pca组。
具体实施方式
26.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
27.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
28.本发明所述苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸的结构式分别如式(ⅰ)、式(ⅱ)和式(ⅲ)所示：
[0029][0030]
实施例1
[0031]
对前列腺患者和正常人对照者血清中苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸的含量进行检测，检测方法为超高效液相色谱色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法，具体方法如下：
[0032]
1、受试者纳入标准
[0033]
正常人对照者(control组)纳入标准：1)经直肠指检及前列腺b超检查正常；2)排除泌尿系统疾病者，排除各种良恶性肿瘤，排除各种慢性疾病；
[0034]
前列腺癌患者(pca组)纳入标准：1)行血清前列腺特异性抗原(psa)、直肠指检、前列腺超声、多参数磁共振扫描等检查，前列腺穿刺活检病理学明确诊断；无其他系统疾病，无合并其他恶性肿瘤病史；2)前列腺癌分期参照2017年美国癌症分期联系委员会制定的tnm 分期系统；3)所有患者未经任何放疗、化疗、手术去势、药物去势者及手术切除。
[0035]
所有受试者都签署患者知情同意书，本次研究经过广州市番禺区中心医院伦理委员会批准。
[0036]
正常人对照组和前列腺癌患者组的相关信息如表1所示：
[0037]
表1正常人与前列腺癌患者相关信息
[0038][0039]
2、标本采集
[0040]
所有受试者术前抽取清晨空腹静脉血(采血前1周禁行直肠指诊、按摩、穿刺等检查操作)3ml收集血清并在-80摄氏度下保存至分析。
[0041]
3、含量检测
[0042]
基于超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的平台分析用甲醇提取的血清中的提取物，并结合uhplc-三重四极杆质谱靶向分析有机酸。质谱下机原始数据通过proteowizard软件包(v3.0.8789)4中msconvert工具将原始质谱raw文件转换为mzxml文件格式。采用 rxcms软件包回进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表。采用公共数据库 hmdb、metlin、massbank、lipidmaps、mzcloundi、kegg及自建物质库进行物质的鉴
定。基于qc样本的loess信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。数据质控中过滤掉qc 样本中rsd》30％的物质。具体如下：
[0043]
(1)配置标准品溶液
[0044]
称取苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、dl-3-苯基乳酸和柠檬酸标准品适量，用甲醇或水配制单标母液。量取各母液适量制成混合标准品，用30％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)逐一稀释至合适浓度，制成工作标准溶液。苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、dl-3-苯基乳酸和柠檬酸的信息及各浓度点分别见表2和表3。母液及工作标准溶液均保存于0℃。
[0045]
表2标准品信息
[0046][0047][0048]
表3各浓度点
[0049][0050]
注：浓度单位:ng/ml。
[0051]
(2)血清样品处理
[0052]
精确吸取适量血清样品于2ml ep管中，准确加入400μl 30％甲醇水溶液(含0.1％甲酸)，涡旋震荡60s，4℃，12000rpm离心10min，取上清液加入到检测瓶中。
[0053]
(3)检测参数
[0054]
色谱条件：采用acquity
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beh c18色谱柱)，进样量5μl，柱温40℃，流动相a-水(含0.1％甲酸)，b-甲醇水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱条件为0～6min，28％b；6～9 min，25～40％b；9～10min，40～50％b；10～11min，50％b；11～12min，28％b。流速：0.25 ml/min。
[0055]
质谱条件：电喷雾电离(esi)源，负离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电。-4500 v，碰撞气6psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(mrm)进行扫描。用于定量分析的离子对见下表4。
[0056]
表4用于分析的定量离子对
[0057][0058]
分别对各工作标准溶液和样品进行检测。以工作标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察线性范围及绘制标准曲线，得到回归方程，分别如下：
[0059]
苹果酸：y＝-1096.7 544.1*x，r＝0.9968；
[0060]
3-羟基-3-甲基谷氨酸：y＝-931.98 467.41*x，r＝0.9977；
[0061]
dl-3-苯基乳酸：y＝-1822.7 2156.3*x，r＝0.9969；
[0062]
柠檬酸：y＝-5580 332*x，r＝0.9965。
[0063]
根据上述回归方程和各物质对应的峰面积计算样品中各物质的含量。
[0064]
(4)统计分析
[0065]
采用r软件包ropls分别对样本数据进行主成分分析(pca)、偏最小二乘判别分析 (pls-da)、正交偏最小二乘判别分析(opls-da)降维分析。根据t检验计算p-value值、 pls-da降维方法计算变量投影重要度(vip)、foldchange计算组件差异倍数，衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选。当p-value值《0.05和vip值》1时，认为代谢物分子具有统计学意义。使用受试者工作特征曲线(auc)下的面积来评估模型在每次比较中识别患者的诊断准确性。auc《0.5时，表示诊断无意义； auc＝0.5～0.7时，表示诊断准确性较低；auc＝0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；auc》0.9 时，表示诊断准确性高。
[0066]
(5)结果
[0067]
前列腺癌患者组与正常对照者组血清中苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸的z-score结果如图1所示。
[0068]
如图2所示，统计分析结果显示，苹果酸在前列腺癌患者组中的含量显著高于正常对照者组，roc曲线分析表明，auc为0.862，特异性为82.7％，敏感性为76.3％。
[0069]
与正常对照者组相比，3-羟基-3-甲基谷氨酸在前列腺癌患者组中的含量显著升高，auc 为0.804，特异性为71.2％，敏感性为84.2％(图3)。
[0070]
dl-3-苯基乳酸在前列腺癌患者组中的含量显著低于正常对照者组，auc为0.713，特异性为63.5％，敏感性为73.7％(图4)。
[0071]
三者的roc曲线分析结果具体如表5所示，表中threshold为roc曲线最佳截断值：
[0072]
表5 roc曲线分析结果
[0073][0074]
上述结果表明，苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和dl-3-苯基乳酸可作为前列腺癌检测的相关标志物，具有较好的诊断性能，尤其是苹果酸，检测性能更好。
[0075]
进一步进行标志物联合分析发现，当苹果酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸与dl-3-苯基乳酸联用时，auc为0.911，特异性为94.7％，敏感性为76.9％(图6)，诊断准确性很高。
[0076]
此外，发明人还发现，将本发明标志物与柠檬酸联合使用能进一步提升诊断性能：当苹果酸与柠檬酸联用时，auc为0.899，特异性为95％，敏感性为85％(图5)。
[0077]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。