本发明属于生物工程，涉及人源化i型胶原蛋白，本发明还涉及该胶原蛋白的表达载体，本发明还涉及该胶原蛋白的制备方法及应用。
背景技术：
1、目前的研究已发现人体中27种型别的胶原蛋白。其中，i型胶原蛋白占85％以上，是皮肤、骨、肌腱以及其他纤维结蹄组织的重要结构成分，i型胶原蛋白属于序列保守型的蛋白质，在哺乳动物不同种属之间氨基酸种类、数目和排列顺序基本相同，因此抗原性很低，且具有很好的生物相容性、生物降解性及生物活性，广泛的应用于医药化工、食品和化妆品中。
2、i型胶原蛋白组织纤维较粗，排列纵横紧密，主要决定皮肤或粘膜的韧性和强度，可以将皮肤细胞撑起，达到舒展皱纹，淡化细纹的功效，并且它具有强的促进角质形成细胞黏附和迁移的功能。还可以通过整合素、盘蛋白结构域受体、糖蛋白等跨膜受体向细胞内传递不断变化的外源刺激信号，从而起到信号分子的作用，与此同时，胶原蛋白还具有信号“中转站”的功能，它能够截留、贮存、运输生长因子，从而在器官发育、伤口愈合和组织修复等过程中充当重要角色。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供人源化i型胶原蛋白，公开了一种与人体100％同源、无免疫反应的人源化i型胶原蛋白及其制备方法，以此方法产生的胶原蛋白具有良好的功能性、组织相容性和生物安全性，丰富了胶原蛋白市场的多元化发展。
2、本发明的第二个目的是提供上述人源化i型胶原蛋白的表达载体。
3、本发明的第三个目的是提供上述人源化i型胶原蛋白的制备方法。
4、本发明的第四个目的是提供上述人源化i型胶原蛋白的应用。
5、本发明所采用的第一个技术方案是，人源化i型胶原蛋白，人源化i型胶原蛋白氨基酸序列如seq id no.3所示，人源化i型胶原蛋白核苷酸序列如seq id no.4所示，人源化i型胶原蛋白氨基酸序列包含600个氨基酸，分子量为53254da，该氨基酸序列与人体内i型胶原蛋白序列同源，该氨基酸序列中包含6组ger序列，该氨基酸序列中包含5组rgd序列。
6、本发明所采用的第二个技术方案是，人源化i型胶原蛋白的表达载体为ppic9k-col1a1，工程菌为gs115-ppic9k-col1a1，工程菌gs115-ppic9k-col1a1属巴斯德毕赤酵母，gs115-ppic9k-col1a1菌种保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为cctcc no：30001，保藏日期：2024年3月11日。
7、本发明的特点还在于：
8、ppic9k-col1a1质粒获得的具体方法为：选用ppic9k载体，对ppic9k载体5708bp处xho i位点由ctcgag突变为cacgag，得到突变后ppic9k载体；
9、在天然人i型胶原蛋白核苷酸系列基础上，对其进行毕赤酵母密码子优化，通过全基因合成的方法，合成经优化后的人源化i型胶原蛋白组合肽链的核苷酸序列，如seq idno.4所示，并在5’端添加xho i酶切位点ctcgag及ppic9k载体上xho i酶切位点紧随的同源序列aaaagagaggct，共计18个碱基；3’端添加taa终止密码子和ecor i酶切位点gaattc，共计9个碱基，全基因合成xho i－seq id no.4－ecor i串联核苷酸序列；
10、对串联核苷酸序列和突变后ppic9k载体分别进行xho i和ecor i双酶切，获得串联核苷酸序列/x+e和ppic9k/x+e，将串联核苷酸序列/x+e和ppic9k/x+e连接转化大肠杆菌感受态，构建获得ppic9k-col1a1载体。
11、工程菌gs115-ppic9k-col1a1通过筛选所得，具体步骤如下：
12、将ppic9k-col1a1质粒进行限制性内切酶sal i线性化，得到ppic9k-col1a1线性化质粒，将ppic9k-col1a1线性化质粒转化到毕赤酵母gs115感受态细胞内，并进行组氨酸缺陷筛选和4g/ml遗传霉素筛选，获得阳性克隆子gs115-ppic9k-col1a1菌株；
13、将gs115-ppic9k-col1a1菌株接种bmgy培养基进行摇瓶实验，甲醇诱导表达，收集摇瓶上清进行sds-page电泳检测，筛选获得与理论分子量一致的表达菌株。
14、本发明所采用的第三个技术方案是，人源化i型胶原蛋白的制备方法，具体步骤如下：
15、s1：以人i型胶原蛋白原始氨基酸系列为模板，进行片段截取及拼接，获得人源化i型胶原蛋白col1a1氨基酸序列，经密码子优化获得核苷酸序列；
16、s2：对ppic9k载体进行突变，全基因合成串联核苷酸序列，对突变后的载体和串联核苷酸序列分别进行双酶切，然后连接转化大肠杆菌感受态，获得ppic9k-col1a1质粒；
17、s3：对s2得到的ppic9k-col1a1质粒进行转化筛选及摇瓶实验，得到筛选获得与理论分子量一致的表达菌株；
18、s4：将s3中筛选到的工程菌株进行发酵放大，得到含有目的蛋白人源化i型胶原蛋白的上清液；
19、s5：对的含有目的蛋白人源化i型胶原蛋白的上清液进行蛋白纯化及鉴定，即得到人源化i型胶原蛋白。
20、本发明的特点还在于：
21、s1中人源化i型胶原蛋白col1a1氨基酸序列获得的方法具体如下：
22、人源化i型胶原蛋白氨基酸序列以人i型胶原蛋白原始氨基酸系列为模板，截取n端1091至1095位aas和583至1169位aas进行拼接，共592个氨基酸，c端添加dpgergkp修饰，共8个氨基酸，拼接成600个氨基酸的人源化i型胶原蛋白组合肽链，人源化i型胶原蛋白原始氨基酸如seq id no.1所示，c端添加修饰的氨基酸序列如seq id no.2所示。
23、s3具体方法如下：
24、将s2所得的ppic9k-col1a1质粒进行限制性内切酶sal i线性化，得到ppic9k-col1a1线性化质粒，将ppic9k-col1a1线性化质粒转化到毕赤酵母gs115感受态细胞内，并进行组氨酸缺陷筛选和4g/ml遗传霉素筛选，获得阳性克隆子gs115-ppic9k-col1a1菌株；
25、将gs115-ppic9k-col1a1工程菌株接种bmgy培养基进行摇瓶实验，甲醇诱导表达，收集摇瓶上清进行sds-page电泳检测，筛选获得与理论分子量一致的表达菌株。
26、s4具体方法为：将筛选到的工程菌株接种于bmgy培养基中，30℃振荡培养至od600达9.8～10.2，转接于装有fbs培养基的发酵罐中，温度恒定为28～30℃，用氨水调ph值至5.3～5.7，溶氧控制在20％～30％，小罐培养16～20h，转接入大罐进行发酵放大，诱导发酵40～44h，发酵结束后，发酵液通过离心进行固液分离，保留上清液，得到含有目的蛋白人源化i型胶原蛋白的上清液。
27、s5具体方法为：取发酵上清液，离心去除菌体，利用0.22μm中空纤维超滤膜过滤器进行过滤，超滤浓缩上清液至原体积的20％，通过凝胶过滤法脱除超滤浓缩液中的无机盐，得到脱盐液，对脱盐液进行离子交换层析处理，分段收集洗脱液，对洗脱液进行浓缩冻干，即得人源化i型胶原蛋白冻干粉。
28、本发明所采用的第四个技术方案是，人源化i型胶原蛋白在美容护肤、修复辅料、医美产品及医疗器械领域中的应用。
29、本发明的有益效果是：本发明提供的人源化i型胶原蛋白人体100％同源、无免疫反应，以此方法产生的胶原蛋白具有良好的功能性、显著的紧致抗皱功效、组织相容性和生物安全性，可广泛应用于美容护肤、修复辅料、医美产品及医疗器械领域，丰富了胶原蛋白市场的多元化发展。
1.人源化i型胶原蛋白，其特征在于，所述人源化i型胶原蛋白氨基酸序列如seq idno.3所示，所述人源化i型胶原蛋白核苷酸序列如seq idno.4所示，所述人源化i型胶原蛋白氨基酸序列包含600个氨基酸，分子量为53254da，所述该氨基酸序列与人体内i型胶原蛋白序列同源，所述该氨基酸序列中包含6组ger序列，所述该氨基酸序列中包含5组rgd序列。
2.如权利要求1所述人源化i型胶原蛋白的表达载体，其特征在于，所述人源化i型胶原蛋白的表达载体为ppic9k-col1a1，所述工程菌为gs115-ppic9k-col1a1，所述工程菌gs115-ppic9k-col1a1属巴斯德毕赤酵母，所述gs115-ppic9k-col1a1菌种保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为cctcc no：30001，保藏日期：2024年3月11日。
3.根据权利要求2所述人源化i型胶原蛋白的表达载体，其特征在于，所述ppic9k-col1a1质粒获得的具体方法为：选用ppic9k载体，对所述ppic9k载体5708bp处xho i位点由ctcgag突变为cacgag，得到突变后ppic9k载体；
4.根据权利要求2所述人源化i型胶原蛋白的表达载体，其特征在于，所述工程菌gs115-ppic9k-col1a1通过筛选所得，具体步骤如下：
5.人源化i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
6.根据权利要求5所述人源化i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述s1中人源化i型胶原蛋白col1a1氨基酸序列获得的方法具体如下：
7.根据权利要求5所述人源化i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述s3具体方法如下：
8.根据权利要求5所述人源化i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述s4具体方法为：将筛选到的工程菌株接种于bmgy培养基中，30℃振荡培养至od600达9.8～10.2，转接于装有fbs培养基的发酵罐中，温度恒定为28～30℃，用氨水调ph值至5.3～5.7，溶氧控制在20％～30％，小罐培养16～20h，转接入大罐进行发酵放大，诱导发酵40～44h，发酵结束后，发酵液通过离心进行固液分离，保留上清液，得到含有目的蛋白人源化i型胶原蛋白的上清液。
9.根据权利要求5所述人源化i型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述s5具体方法为：取发酵上清液，离心去除菌体，利用0.22μm中空纤维超滤膜过滤器进行过滤，超滤浓缩上清液至原体积的20％，通过凝胶过滤法脱除超滤浓缩液中的无机盐，得到脱盐液，对所述脱盐液进行离子交换层析处理，分段收集洗脱液，对洗脱液进行浓缩冻干，即得人源化i型胶原蛋白冻干粉。
10.根据权利要求5～9任一所述的人源化i型胶原蛋白在美容护肤、修复辅料、医美产品及医疗器械领域中的应用。
