一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗及其制备方法与流程

1.本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)属尼多目、冠状病毒属，病毒核酸是具有感染性的线性单股正链无节段rna。由于pedv基因碱基的突变缺失和插入，导致pedv基因的多样性。目前pedv可以分为经典的gi-a、gi-b和变异株gii-a、gii-b,我国猪场流行的就是变异株gii-a、gii-b。gii-a、gii-b毒株致病性强，能交叉保护，但研究显示gii-a毒株比gii-b毒株能更好的调节机体产生免疫保护抵抗相应亚型的pedv的感染。目前我国主要流行gii-a毒株，就当前国内猪群中ped的防治效果而言，疫苗免疫仍是控制该病发生、流行和降低病死率的最佳方法。本研究的疫苗，pedv属于gii-a，能够很好地提供免疫保护，抵抗pedv的感染。
3.轮状病毒(rotaviruse，rv)属于呼肠孤病毒科(reoviridae)轮状病毒属(rotavirus)为双股rna(dsrna)病毒，编码6种结构蛋白(vp1-vp4,vp6和vp7)和5种非结构蛋白(nap1-npa5/6)。vp6由病毒第6基因片段编码，三聚体形式构成核衣壳的中层，387个氨基酸组成，分子量约为40kd，蛋白含量最高，占病毒蛋白的51％，vp6是抗原性强的蛋白质，并且可以被用来分辨轮状病毒的种类。轮状病毒具有不同的血清群和血清型，根据vp6分为7个抗原性存在差异的血清群(型)(a-g)及两个亚群(ⅰ和ⅱ)；a亚群轮状病毒是引起人类和动物胃肠道疾病的主要病原，其病毒粒子表面共有三种抗原，分别为群抗原、中和抗原和血凝素抗原。vp6蛋白是群抗原，vp7蛋白是中和抗原，vp4蛋白是血凝素抗原。依据vp4的不同可将porv分为不同的p型；依据vp7的不同可将轮状病毒分为不同的g型。通常以vp7和vp4基因片段对应的基因型组合gx-p[x]来表示毒株的基因型，且g型和p型之间会产生多种组合，不同组合的血清型之间交叉保护性低，迄今为止，在人员rva毒株中，最常见的基因组合型为g1p[8]、g2p[4]、g3p[8]、g4p[8]、g9p[8]和g12p[8]，在猪中，已鉴定出rva的12种g型(g1-g6、g8-g12和g26)和16种p型(p[1]-p[8]、p[13]、p[19]、p[23]、p[26]-p[28]、p[32]和p[34])。猪轮状病毒(porcine rotavirus，porv)有四个血清群(型)(a、b、c和e)。其中porv血清a型轮状病毒，是引起断奶前后仔猪腹泻最常见的亚型，由porv引起商品化猪群的腹泻病中占90％以上。中国流行病学调查显示，2016年到2020年g9基因型是主要的新流行毒株。
[0004]
pedv和porv是引起仔猪腹泻的主要病原，这两种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上也极其相似，但是彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。由此可见，同时防控两种疾病显得尤为重要。目前因pedv、porv等混合感染而引起的疾病是全球养猪业的一大问题，国内有这两种病毒的疫苗，但由于都是在2010年以前申报的新药，经过10年的发展，这两种病毒都发生了变异，主要的流行基因型也改变了，这也表现在很多免疫了疫苗的规模化猪场仍然爆发猪的腹泻。分离获得当前流行的毒株(pedv为gii-a，porv为g9型)作为候选疫苗株，具有更好的免疫效果，对于阳性猪场净化pedv和porv
及国内pedv和porv的防控具有重要的意义。
[0005]
细胞分离培养的成功与否是疫苗研制的关键之一，目前报道过使用非洲绿猴肾传代细胞(cv-1)、恒河猴传代细胞系(ma-104)成功分离和增殖rv株，rv体外培养成功与否固然取决于细胞种类，更重要的是用胰酶处理细胞、震荡和培养温度以及粪液中病毒粒子的完整性，clark等和barmett等的研究表明，胰酶直接作用于病毒颗粒而不是宿主细胞，graham等认为，胰酶最初是作用于复制阶段，在胞外环境中直接影响病毒粒子，从而使非感染性的病毒粒子转变为感染性的病毒粒子。关于胰酶促进rv感染性的机制，可能是由于细胞的直接影响或破坏了病毒增殖的抑制机制，目前ma-104被认为是rv生长最适宜的细胞，研究还表明在接种病毒后转瓶培养易出现cpe，此外维持液不含血清，但含胰酶培养细胞出现cpe的时间要比维持液含血清及胰酶培养的快，cpe程度也更高，目前的研究表明培养出猪轮状病毒的最佳条件为：
[0006]
1)采用ma-104细胞培养；
[0007]
2)病毒接种前用终浓度10μg/ml胰酶37℃作用30min,病毒接种后37℃、5％co2转瓶培养；
[0008]
3)维持液中不加血清，但含有1～2μg/ml胰酶。


技术实现要素：

[0009]
本发明要解决的技术问题是针对目前市场上缺少免疫效果好、安全可靠的猪流行性腹泻、猪轮状病毒灭活疫苗，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒灭活疫苗及其制备方法，以实现用简单实用的制备方法生产出免疫保护率高、产量高、稳定性好、成本低、安全可靠的疫苗。
[0010]
本发明的一个目的是提供一株猪轮状病毒ch09株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：v202191，属于g9p[23]基因型。属于当前爆发的流行基因型。
[0011]
上述的猪轮状病毒ch09株，该ch09株的vp4基因序列如seq id no：01所示，ch09株的vp7基因序列如seq id no：02所示。
[0012]
ch09株与对比毒株vp4基因的同源性为93.56％；ch09株与对比毒株vp4基因的同源性为93.17％。
[0013]
本发明的另一个目的是提供所述的猪轮状病毒ch09株在制备猪轮状病毒疫苗中的应用，如：一种组合物，其包含灭活后的所述猪轮状病毒ch09株，以及药学上可接受的载体。
[0014]
优选地，一种组合物，其包含灭活后的所述猪轮状病毒ch09株，保藏号为cctcc no：202005的猪流行性腹泻病毒2a kq01株，以及药学上可接受的载体。
[0015]
pedv和porv是引起仔猪腹泻的主要病原，这两种病毒引起的疾病在流行病学和病理剖检上也极其相似，但是彼此又没有共同的抗原性，在免疫学和血清学上相互没有交叉反应。因pedv、porv等混合感染而引起的疾病是全球养猪业的一大问题，制备二联疫苗，可以打一针免疫两种病毒，减少猪的应激反应。
[0016]
优选地，猪流行性腹泻2a kq01株、猪轮状病毒ch09株二联灭活疫苗，所述二联疫苗灭活疫苗是将权利5所述的猪流行性腹泻2a kq01株、猪轮状病毒ch09株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。
[0017]
优选地，收获的猪流行性腹泻2a kq01株的病毒液滴度不低于10
7.0
tcid50/ml，收获的猪轮状病毒ch09株的病毒液滴度不低于10
8.0
tcid
50
/ml；两种病毒灭活后等体积比混合。
[0018]
优选地，所述的二联灭活疫苗，其中，所述佐剂为ims1313。
[0019]
本发明另一目的是提供所述的猪轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0020]
步骤s1.当生物反应器中pk15细胞密度达到5.0～7.0
×
106个/ml且细胞活率为95％以上时，用pk15无血清培养基将细胞密度稀释至2
×
10
6-3
×
106个/ml，加入的胰酶终浓度为6ug/ml，按接毒剂量为0.5moi接种猪轮状病毒，37℃继续培养，设置培养条件为37℃，ph 7.2-7.4，do 40％-60％，50rpm
±
5rpm；
[0021]
步骤s2.接毒后24h，收获病毒液。
[0022]
在悬浮型pk-15细胞上培养出的ch09株病毒滴度为10
9.0
～10
9.75
之间，悬浮型pk-15细胞增值的猪轮状病毒克隆毒比ma104细胞高1个滴度，收获的病毒液体积也相对较少，生产效益最大。
[0023]
优选地，步骤s2前还包括步骤s1：从液氮罐中取出冻存的悬浮型pk-15细胞后，水浴复苏，用pk-15细胞培养基重悬细胞后，转接于生物反应器中，补加pk-15细胞培养基至细胞初始密度为1.0
×
106个/ml进行传代，在37℃、130r/min、5％co2水平摇床中培养72-96小时，至细胞密度可达5.0～7.0
×
106个/ml且细胞活率为95％以上。
[0024]
pk-15细胞初始密度为1.0
×
106个/ml进行传代后细胞的密度高，在稀释到理想接毒密度时生产效益最大，细胞存活率高，细胞状态稳定，适合接种病毒，收毒。
[0025]
进一步地，所述猪轮状病毒为猪轮状病毒ch09株。
[0026]
本发明的有益效果：
[0027]
1.本方案选用当前流行的基因型毒株来制备疫苗，保证了疫苗种毒的优势；
[0028]
2.本方案所制备的pedv-porv二联灭活疫苗稳定性好，经克隆纯化后保持了病毒的纯净性和稳定性。
[0029]
3.本方案所制备的pedv-porv二联灭活疫苗安全性高，免疫原性好；
[0030]
4、本方案采用纯悬浮技术工艺，所生产的病毒毒价更高，操作更方便。
[0031]
本方案将为临床上针对猪流行性腹泻和猪轮状病毒病的防控以及猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒在猪群中的清除提供物质基础和技术支撑，具有广阔的应用前景。
[0032]
本发明采用当前pedv和porv流行的基因型毒株作为种毒，通过甲醛灭活，与水佐剂ims1313乳化后制备成pedv-porv二联灭活疫苗。本研究制备的二联灭活疫苗具有免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠的的特点，能够用于pedv和porv疫情爆发时预防接种。
附图说明
[0033]
图1猪流行性腹泻病毒分离鉴定中2a kq01株病变结果；
[0034]
图2猪流行性腹泻病毒分离鉴定中2a kq01株rt-pcr结果鉴定结果；
[0035]
图3猪流行性腹泻病毒克隆纯化中2a kq01株克隆毒株rt-pcr鉴定结果；
[0036]
图4猪流行性腹泻病毒克隆纯化中2a kq01株克隆毒株间接免疫荧光鉴定结果；
[0037]
图5猪流行性腹泻病毒生物学特性研究中2a kq01株克隆毒株电镜鉴定结果；
[0038]
图6猪轮状病毒的分离鉴定中ch09株病变结果图；
[0039]
图7猪轮状病毒的分离鉴定中ch09株rt-pcr鉴定结果图；
[0040]
图8猪轮状病毒的克隆纯化中ch09株克隆毒株rt-pcr鉴定结果图；
[0041]
图9猪轮状病毒的克隆纯化中ch09株克隆毒株间接免疫荧光鉴定结果图；
[0042]
图10猪轮状病毒的生物学特性研究中ch09株克隆毒株电镜鉴定结果图
[0043]
图11 ch09株vp7基因核苷酸进化树分析结果图；
[0044]
图12 ch09株vp4基因核苷酸进化树分析结果图；
[0045]
图13 ch09株克隆毒株vp4和vp7基因与对比毒株的同源性分析结果图。
具体实施方式
[0046]
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例中采用的仪器、试剂等，如无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂，可通过商业途径获得。
[0047]
实施例1猪流行性腹泻病毒的分离鉴定、克隆纯化与生物学特性研究
[0048]
1.1病料和细胞
[0049]
病料来源于我国规模化猪场具有腹泻临床症状发病猪的小肠，vero细胞由科前生物股份有限公司研发中心实验室保管和供应。本实施例使用猪流行性腹泻病毒是专利cn111041002b中记载的已保藏的，保藏编号为：cctcc no：202005的猪流行性腹泻病毒2a kq01株。
[0050]
1.2病毒的分离鉴定
[0051]
利用特异性引物，扩增pedv m基因，引物序列为：
[0052]
上游引物pedv-ms：5
’‑
atgtctaacggttctattcccgt-3’[0053]
下游引物pedv-ma：5
’‑
cttggcgactgtgacgaaat-3’[0054]
扩增片段大小为519bp，引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。
[0055]
pcr反应体系：
[0056]
表1
[0057]
evo m-mlvrtase1μl2
×
one-step master mix10μlpedv-ms1μlpedv-ma1μl模板2μlrnase free dh2o5μl
[0058]
反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性5min后进入循环，循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延申30s；35个循环后72℃延伸10min；4℃保存。用pedv m基因的特异性引物对分离病毒的细胞培养物进行rt-pcr扩增，另设空白对照。
[0059]
rt-pcr检测为pedv阳性的病料研磨和过滤除菌后，接种已长成单层的vero细胞(接种前倒掉细胞培养液，用pbs洗2次)，37℃吸附1h，吸弃接种物，补加5ml的细胞维持液，继续培养，每天观察，如出现细胞病变即及时收毒，如无细胞病变出现，则在培养72h时收毒，并继续盲传，若盲传7代后仍无病变者弃去不要。
[0060]
将rt-pcr检测为阳性的猪小肠组织处理后接种于已长成单层的vero细胞，结果有
1份样品在盲传2代后开始出现病变，主要表现为细胞轮廓变模糊、细胞拉网、形成合胞体，最终脱落、裂解(图1)。
[0061]
以猪流行性腹泻病毒2a kq01株的f5代rna作为模板，利用特异性引物扩增pedv m基因，结果均获得特异性片段，大小为519bp(图2)，说明所分离的病毒为pedv。
[0062]
1.2病毒的克隆纯化
[0063]
克隆纯化方法：用含10μg/ml胰酶的无血清dmem将分离的pedv按照10-1
、10-2
、10-3
、10-4
和10-5
稀释，取500μl的病毒液接种vero细胞(接种前用pbs洗2次)已长成单层的6孔细胞培养板，于37℃5％co2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，用pbs洗2次，覆盖含7.5μg/ml胰酶、0.8％低熔点琼脂糖的无酚红dmem，于37℃5％co2培养箱中继续培养2d～3d，在显微镜下看到明显的空斑出现后，用0.1
‰
的中性红于37℃染色1h，吸弃染色液，挑取空斑于200μl维持液中，反复冻融3次，接种vero细胞(接种前用pbs洗2次)已长成单层的24孔细胞培养板，于37℃5％co2培养箱吸附1h后补加0.8ml含10μg/ml胰酶的无血清dmem，于37℃5％co2培养箱中培养至完全发生病变后，收集病变的细胞培养物，冻融3次后，测定各克隆毒的tcid
50
，选择毒价高的克隆如上再纯化2次，选择毒价高的克隆毒用于后续研究。
[0064]
为了获得增殖滴度高、纯粹性好的病毒，本实施例对猪流行性腹泻病毒2a kq01株进行了克隆纯化。在第一轮空斑纯化时每个毒株挑取了10个克隆，接种24孔板培养的细胞后选取病变典型的克隆毒测定了tcid
50
，以tcid
50
高的克隆毒再进行下一轮空斑纯化，如此共纯化3次。成功获得了猪流行性腹泻病毒2a kq01株的克隆毒，选取第三轮空斑纯化毒中毒价最高的克隆毒，将其记为第一代毒，f1代。
[0065]
在悬浮型st细胞上进行传代，一直传到第20代，并测定偶数代病毒的含量，结果显示猪流行性腹泻病毒2a kq01株病毒随着传代次数的增加毒价升高明显，到第5代已达到10
7.0
tcid
50
/ml，并且第4代以后的毒的毒价均不低于10
7.0
tcid
50
/ml，说明猪流行性腹泻病毒2a kq01株在悬浮型st细胞上的增殖能力强、适应性好(表1)。悬浮培养st细胞的st无血清培养基购自甘肃健顺生物科技有限公司。
[0066]
表2 3株克隆毒vero细胞上的增殖滴度(tcid
50
/ml)
[0067][0068]
1.3克隆毒的纯净性检验
[0069]
按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。
[0070]
1.4克隆毒的特异性检验
[0071]
利用特异性引物，扩增pedv m基因，引物序列为：
[0072]
上游引物pedv-ms：5
’‑
atgtctaacggttctattcccgt-3’[0073]
下游引物pedv-ma：5
’‑
cttggcgactgtgacgaaat-3’[0074]
扩增片段大小为519bp，引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。
[0075]
pcr反应体系：
[0076]
表3
[0077]
evo m-mlvrtase1μl2×
one-step master mix10μlpedv-ms1μlpedv-ma1μl模板2μlrnase free dh2o5μl
[0078]
反应条件为：50℃反转录30min；94℃变性5min后进入循环，循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延申30s；35个循环后72℃延伸10min；4℃保存。
[0079]
以猪流行性腹泻病毒2a kq01株克隆毒的f5、f10和f15代的rna为模板，利用特异性引物rt-pcr扩增pedv m基因，结果均获得特异性片段，大小为519bp(图3)，说明克隆毒为pedv。
[0080]
1.5克隆毒的间接免疫荧光检测
[0081]
用pedv单克隆抗体作为一抗，将猪流行性腹泻病毒2a kq01株克隆毒的f5、f10和f15代进行间接免疫荧光试验，在荧光显微镜下观察，可见猪流行性腹泻病毒2a kq01株克隆毒出现绿色的特异荧光，vero细胞对照孔内未见荧光，背景干净，结果表明所分离的病毒为pedv(图4)。
[0082]
克隆毒的间接免疫荧光检测方法如下：将vero细胞接种于24孔板内，待细胞长成单层弃去培养液，用含7.5μg/ml的无血清dmem洗两遍，每孔接300μl病毒液，同时设细胞对照，置于37℃二氧化碳细胞培养箱孵育1h，弃病毒液，然后加1ml/孔含7.5μg/ml的无血清dmem；24h后弃去培养液，用pbs洗一遍，然后加入冰冷的无水乙醇，-20℃固定30min；弃固定液，pbs洗三遍，加入5％bsa 37℃封闭1h；弃封闭液加入pedv单克隆抗体37℃孵育1h；弃一抗，pbs洗三遍，加入fitc标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1h；弃二抗，pbs洗三遍，加入pbs在荧光显微镜下观察。
[0083]
1.6克隆毒的电镜检测
[0084]
为进一步对猪流行性腹泻病毒2a kq01株的形态观察，将浓缩的猪流行性腹泻病毒2a kq01株克隆毒f5代悬液经过负染后进行电镜观察，取1l病毒悬液，10000r/min，离心10min，取上清，30000r/min超速离心2h；弃上清，用4ml pbs重悬沉淀；经不同蔗糖密度梯度离心后，选取40％～50％蔗糖层脱糖后，用300μl pbs重悬，吸取25μl滴于铜网上，做负染色，置于透射电镜下观察。
[0085]
结果显示，病毒粒子形态大致呈圆形，包括纤突结构部分的粒子直径约为70～120nm，四周有明显的呈放射状的棒状突起，是冠状病毒的典型特征(图5)。
[0086]
1.7克隆毒的免疫原性测定。
[0087]
将猪流行性腹泻病毒2a kq01株克隆毒f6代病毒制备的灭活疫苗免疫仔猪，于免疫后21天分别采血，分离血清，检测pedv中和抗体：
[0088]
向克隆毒的f6代病毒液中分别加入甲醛至终浓度为0.25％，37℃灭活48h。将灭活好的病毒液预热至37℃，与水佐剂ims1313按体积比3：1混合后乳化。灭活前将病毒含量调整为10
7.0
tcid
50
/ml。
[0089]
将pedv、porv中和抗体均不高于1:4的母猪所产3～5日龄仔猪10头，分为2组，每组5头，第1组为2a kq01株10
6.5
tcid
50
/ml灭活疫苗免疫组，免疫途径为颈部肌肉接种，1ml/头，第2组为空白对照组。于免后21天采血，分离血清，测定血清中pedv中和抗体。
[0090]
结果：猪流行性腹泻病毒2a kq01株10
7.0
tcid
50
/ml免疫猪血清的中和抗体均不低于1:16，最高达到1:64；对照组中和抗体均不高于1:4(表4)，说明猪流行性腹泻病毒2a kq01株的免疫原性最好。
[0091]
表4
[0092][0093]
从疑似pedv感染的病猪小肠中分离到了1株pedv病毒，为猪流行性腹泻病毒2a kq01，将这1株病毒克隆纯化后进行了一系列的研究，结果这株病毒都与当前流行的pedv毒株存在高度的同源性，而与经典毒株的关系较远，说明当前流行的毒株与经典株相比已有了较大的变异。并且这株毒株中以猪流行性腹泻病毒2a kq01株在悬浮型st细胞上的增殖滴度最高，对仔猪的毒力最强，免疫原性最好，因此确定猪流行性腹泻病毒2a kq01株作为猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗生产和检验用毒株。
[0094]
实施例2 猪轮状病毒的分离鉴定、克隆纯化与生物学特性研究
[0095]
1.1病料和细胞
[0096]
病料来源于我国规模化猪场具有腹泻临床症状发病猪的小肠，ma104细胞由科前生物股份有限公司研发中心实验室保管和供应。悬浮型pk-15细胞由武汉科前生物股份有限公司保管和供应。本发明中，用于悬浮培养pk-15细胞的培养基(pk无血清培养基)购自浙江壹生科生物科技有限公司，货号zj02f1170。
[0097]
1.2病毒的分离鉴定
[0098]
利用特异性引物，扩增porv vp6基因，引物序列为：
[0099]
上游引物porv-jds：5
’‑
atttgatgggaactatgtgg-3’[0100]
下游引物porv-jda：5
’‑
ggtggacgaactaattgaaacg-3’[0101]
扩增片段大小为350bp，引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。
[0102]
pcr反应体系：
[0103]
表5
[0104]
evo m-mlvrtase1μl2
×
one-step master mix10μlpedv-ms1μlpedv-ma1μl模板2μlrnase free dh2o5μl
[0105]
反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性5min后进入循环，循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延申30s；35个循环后72℃延伸10min。
[0106]
rt-pcr检测为porv阳性的病料研磨和过滤除菌后，接种已长成单层的ma104细胞(接种前倒掉细胞培养液，用pbs洗2次)，37℃吸附1h，吸弃接种物，补加5ml的细胞维持液，继续培养，每天观察，如出现细胞病变即及时收毒，如无细胞病变出现，则在培养72h时收毒，并继续盲传，盲传7代后仍无病变者弃去不要。
[0107]
结果有1份样品在盲传第1代出现病变，主要表现为细胞固缩、破碎，最后细胞崩解
脱落(图6)，将获得的病毒分别命名为ch09株。以ch09株的f5代rna作为模板，利用特异性引物rt-pcr扩增porv-vp6基因，结果均获得特异性片段，大小为350bp(图7)，说明所分离的病毒为porv。将分离的猪轮状病毒ch09株在2021年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为：猪轮状病毒porv ch09株，保藏编号为cctcc no：v202191，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。
[0108]
1.3病毒的克隆纯化
[0109]
为了获得增殖滴度高、纯粹性好的病毒，对ch09株病毒进行了克隆纯化。克隆纯化方法：用含5μg/ml胰酶的无血清dmem将分离的porv按照10-1
、10-2
、10-3
、10-4
和10-5
稀释，取500μl的病毒液接种ma-104细胞(接种前用pbs洗2次)已长成单层的6孔细胞培养板，于37℃5％co2培养箱中吸附1h，吸弃病毒液，用pbs洗2次，覆盖含5μg/ml胰酶、0.8％低熔点琼脂糖的无酚红dmem，于37℃5％co2培养箱中继续培养2d～3d，在显微镜下看到明显的空斑出现后，用0.1
‰
的中性红于37℃染色1h，吸弃染色液，挑取空斑于200μl维持液中，反复冻融3次，接种ma104细胞(接种前用pbs洗2次)已长成单层的24孔细胞培养板，于37℃5％co2培养箱吸附1h后补加0.8ml含5μg/ml胰酶的无血清dmem，于37℃5％co2培养箱中培养至完全发生病变后，收集病变的细胞培养物，冻融3次后，测定各克隆毒的tcid
50
，选择毒价高的克隆毒如上再纯化2次，选择毒价高的克隆毒用于后续研究。
[0110]
在第一轮空斑纯化时每个毒株挑取了10个克隆，接种24孔板培养的细胞后选取病变典型的克隆毒测定了tcid
50
，以tcid
50
高的克隆毒再进行下一轮空斑纯化，如此共纯化3次。成功获得了ch09株的克隆毒，选取第三轮空斑纯化毒中毒价最高的克隆毒将其记为第一代毒，f1代)在ma104细胞上进行传代，一直传到第20代，并测定偶数代病毒的含量，结果ch09株病毒随着传代次数的增加毒价升高明显，到第6代已达到10
8.25
tcid
50
/ml，并且第5代以后的毒的毒价均不低于10
8.0
tcid
50
/ml，说明ch09株在ma104细胞上的增殖能力强(表6)。
[0111]
表6 ch09株克隆毒在ma104细胞上的增殖滴度(tcid
50
/ml)
[0112][0113]
1.4 ch09株在无血清全悬浮pk15细胞中的增殖
[0114]
1.41悬浮型pk-15细胞最佳传代密度与培养时间的确定
[0115]
将冻存的悬浮型pk-15细胞从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴锅中使其迅速融化，融化后将细胞悬液加入到装有新鲜培养基的50ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。用pk-15细胞培养基重悬细胞后，转入三角细胞摇瓶中，补加pk-15细胞培养基至合适体积，使细胞初始密度为1.0
×
106个/ml。在37℃、130r/min、5％co2水平摇床中培养72小时后，细胞密度达到6.0～6.5
×
106个/ml，且细胞活率在95％以上，细胞生长正常后，将细胞悬浮液收集到50ml无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加入新鲜的无血清培养基，轻轻吹散细胞团重悬细胞，分别稀释到0.5
×
106个/ml、1.0
×
106个/ml和1.5
×
106个/ml的细胞密度接种到3个三角细胞摇瓶中进行传代。将接种好细胞的摇瓶放入37℃，5％co2，130r/min条件下的摇床培养箱中进行培养，每24小时取样，显微镜下用台盼蓝染色法计数和计算细胞活率，统计好各时间点的细胞密度和细胞存活率，具体结果如下(表7)。
[0116]
表7不同初始接种密度下各时间点pk-15细胞的密度和活率
[0117][0118]
由表7可知，悬浮型pk-15细胞以1.0
×
106个/ml和1.5
×
106个/ml的密度接种，培养至72小时密度达到较高值，均优于0.5
×
106个/ml的接种密度，但前者的细胞活率略高于后者，三种接种密度条件下的细胞均随着培养时间的延长，细胞活率逐渐下降。在低密度0.5
×
106个/ml接种情况下，由于细胞基数小使细胞前期生长缓慢，直至96小时细胞密度达到最高仅为3.37
×
106个/ml，此时细胞活率为93.56％，推测原因为细胞起始接种密度低，延滞期较长，细胞生长速度慢，培养时间长，培养基的营养消耗大，不利于后期生长；在高密度1.5
×
106个/ml接种情况下，培养48小时，细胞密度就达到4.82
×
106个/ml，继续培养至72小时，密度仅达到6.64
×
106个/ml，没有收获更多的细胞量，反而细胞活率下降为93.77％，推测原因为培养基的营养消耗殆尽，不足以维持细胞生长，细胞代谢物积累较多；而在中密度1.0
×
106个/ml接种情况下，细胞培养72小时，细胞密度达到6.48
×
106个/ml，优于0.5
×
106个/ml低密度接种，与1.5
×
106个/ml高密度相比差异不显著，但此时的细胞活率更高，细胞状态更好。培养至96小时，三种初始接种密度条件下的细胞活率分别为93.57％、93.30％和76.52％，较72小时的细胞活率均有所降低；培养至120小时，细胞活率分别为79.13％、66.03％和46.37％，较96小时的细胞活率进一步降低。因此确定悬浮型pk-15细胞在摇瓶中最佳传代密度为1.0
×
106个/ml，培养时间为72小时。
[0119]
1.42猪轮状病毒ch09株在摇瓶上的增殖工艺的确定
[0120]
接毒时最佳细胞密度的确定：将pk-15细胞用pk-15细胞培养基分别稀释至1.0
×
106个/ml、2.0
×
106个/ml和4.0
×
106个/ml的细胞密度，分别接种到3个三角细胞摇瓶中，并添加终浓度为6μg/ml的胰酶，以0.5moi接种f1代猪轮状病毒ch09株种毒，在37℃、130r/min、含5％co2水平摇床中培养，分别于12小时、18小时、24小时、30小时取样，测定不同时间点取样的病毒液效价，具体结果见表8。
[0121]
表8不同细胞密度接毒收获的病毒液效价(tcid
50
/ml)
[0122][0123]
由表8可知：三个接毒密度下收获的病毒液效价均在24小时达到最高，分别为10
8.25
tcid
50
/ml、10
9.75
tcid
50
/ml和10
9.13
tcid
50
/ml，接毒细胞密度为1.0
×
106个/ml时，单个细胞增殖的病毒粒子有限，细胞密度低导致单位体积内产生的病毒粒子较少，24小时收获的病毒液的效价为10
8.25
tcid
50
/ml，低于2.0
×
106个/ml的接毒细胞密度与4.0
×
106个/ml的接毒细胞密度时的病毒液效价；接毒细胞密度为4.0
×
106个/ml时，由于接毒密度较高，新鲜培养基的补充量少，提供病毒增殖所需营养较少，24小时收获的病毒液效价为10
9.13
tcid
50
/ml，低于2.0
×
106个/ml的接毒细胞密度收获的病毒液效价10
9.75
tcid
50
/ml，收获的病毒液体积也相对较少，根据生产效益最大化原则，确定接毒时最佳细胞密度为2.0
×
106个/ml。
[0124]
接毒时最佳胰酶浓度的确定：将培养了72小时的pk-15细胞用pk-15细胞培养基稀释至2.0
×
106个/ml的细胞密度，分别接种到3个三角细胞摇瓶中，并分别添加终浓度为3μg/ml、6μg/ml和9μg/ml的胰酶，以0.5moi的接毒剂量接种猪轮状病毒ch09株f10代种毒，在37℃、130r/min含5％co2水平摇床中培养，分别于12小时、18小时、24小时、30小时取样，测定不同时间点取样的病毒液效价，具体结果见表9。
[0125]
表9不同胰酶浓度各时间点的病毒液效价(tcid
50
/ml)
[0126][0127]
由表9可知：三个胰酶浓度下收获的病毒液效价均在24小时达到最高，分别为10
8.25
tcid
50
/ml、10
9.63
tcid
50
/ml和10
9.13
tcid
50
/ml，胰酶终浓度为3μg/ml时，由于胰酶浓度偏低导致病毒感染细胞病变不明显；胰酶终浓度为9μg/ml时，可能是高浓度胰酶作用下，细胞状态受损，影响了病毒增殖。考虑到生产效率，因此确定在转瓶中最佳胰酶浓度为6μg/ml。
[0128]
最佳接毒剂量及收毒时间的确定：将pk-15细胞用pk-15细胞培养基稀释至2.0
×
106个/ml的细胞密度，分别接种到3个三角细胞摇瓶中，并添加终浓度为6μg/ml的胰酶，分别按0.1moi、0.5moi和1.0moi的接毒剂量接种猪轮状病毒ch09株f1代种毒，在37℃、130r/min含5％co2水平摇床中培养，分别于12小时、18小时、24小时、30小时取样测病毒液效价，具体结果见表10。
[0129]
表10不同接毒剂量各时间点的病毒液效价(tcid
50
/ml)
[0130][0131]
其中，moi指感染时ch09株病毒与pk-15细胞的数量比值，由表10可知，当以moi为0.1的剂量接毒时，由于接毒量偏少病毒不能完全感染所有细胞，造成收获的病毒液最高效价仅为10
8.13
tcid
50
/ml；当以moi为1.0的剂量接毒时，大量的病毒粒子较快感染了所有细胞，造成收获的病毒液效价在18小时时达到最高，效价为10
9.0
tcid
50
/ml，但整体效价下降较快；当以moi为0.5的剂量接毒时，病毒液效价在24小时达到最高为10
9.63
tcid
50
/ml，显著优于另外两个接毒剂量。因此，确定悬浮型pk-15细胞在摇瓶中培养猪轮状病毒ch09株病毒的最佳接毒剂量为0.5moi，最佳收毒时间为24小时。
[0132]
通过对悬浮型pk-15细胞在摇瓶上传代密度与摇床转速的摸索，确定了悬浮型pk-15细胞在摇瓶的培养工艺为：以1.0
×
106个/ml的初始密度进行稀释传代，在37℃、130r/min、5％co2水平摇床中培养72小时后，细胞密度可达6.0～6.5
×
106个/ml且细胞活率为95％以上时；此外，通过摸索猪轮状病毒ch09株在摇瓶中接毒时细胞密度、胰酶浓度、接毒量、收毒时间等工艺条件，确定了猪轮状病毒ch09株在摇瓶中增殖的最佳工艺条件为：悬浮型pk-15细胞培养72小时，细胞密度达到6.0～6.5
×
106个/ml后，以0.5moi的接毒剂量接种细胞密度为2.0
×
106个/ml的悬浮型pk-15细胞，并添加终浓度为6μg/ml的胰酶，培养24小时收获病毒液。
[0133]
当生物反应器中pk15细胞密度达到5
×
10
6-7
×
106个/ml，用pk15无血清培养基将细胞密度稀释至2
×
10
6-3
×
106个/ml，加入的胰酶终浓度为15ug/，按1％-2％的培养体积接种ch09株，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，ph 7.2-7.4，do 40％-60％，50rpm
±
5rpm。接毒后24h收毒，检测其tcid
50
。在悬浮型pk-15细胞上连续传代，一直传到第20代，并测定偶数代病毒的含量。
[0134]
(表11)
[0135]
表11 ch09株克隆毒悬浮型pk-15细胞上的增殖滴度(tcid
50
/ml)
[0136][0137]
从表6和表的结果可以看出ch09株克隆毒在悬浮型pk-15细胞上增殖能力更强；ch09株克隆毒分别在ma104细胞和悬浮型pk-15细胞连续传20代，检测tcid
50
，结果显示f6代后，ch09株克隆毒在ma104细胞上的病毒滴度为10
8.0
～10
8.25
之间，在悬浮型pk-15细胞上的病毒滴度为10
9.0
～10
9.75
之间，所以悬浮型pk-15细胞增值的ch09株克隆毒比ma104细胞高1个滴度。
[0138]
1、病毒稀释与接种 取100μl病毒样品作10倍系列稀释，取10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
5个稀释度接种预先用无血清dmem培养基洗涤3次的长满单层ma104细胞，每个稀释度加一
纵排共8孔(96孔细胞培养板)，每孔加入100μl。同时设8个正常细胞对照孔，细胞对照孔的单层细胞同样用无血清dmem培养基洗涤3次，并加入100μl含5.0μg/ml胰酶的无血清dmem培养基。置37℃、含5％co2培养箱中继续培养3日。
[0139]
2、细胞固定 弃去细胞培养液，用200μl pbs洗涤3次，每次5min，弃去pbs，每孔加入预冷的甲醇-丙酮(1:1配置)溶液100μl，2～8℃固定30min。
[0140]
3、加封闭液 弃去固定液，用200μl pbs洗涤3次，每次5min，弃去pbs，每孔加入用pbs配制的5％bsa封闭液100μl，置37℃温箱中作用1h。
[0141]
4、加一抗 弃去封闭液，用200μl pbs洗涤3次，每次5min，弃去pbs，每孔加入用pbs按1:200稀释的porv vp6单克隆抗体50μl，置37℃温箱中作用1h。
[0142]
5、加二抗 弃去一抗，用200μl pbs洗涤3次，每次5min，弃去pbs，每孔加入用pbs按1：500稀释的alexa fluor
tm 488标记的羊抗鼠igg 50μl，置37℃温箱中作用1h。
[0143]
6、镜检 弃去二抗，用200μl pbs洗涤3次，每次5min，最后加入100μl pbs，置于荧光显微镜下观察。
[0144]
7、结果判定 细胞对照孔应无特异性荧光信号，检测样品孔若出现绿色荧光信号即判为pcv2感染阳性。
[0145]
8、病毒含量计算 统计每个稀释度病毒接种细胞孔中porv感染阳性的孔数，根据reed-muench法计算猪轮状病毒ch09株的tcid
50
。
[0146]
1.5克隆毒的纯净性检验
[0147]
按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。
[0148]
1.6克隆毒的特异性检验
[0149]
利用特异性引物，扩增porv vp6基因，引物序列为：
[0150]
上游引物porv-jds：5
’‑
atttgatgggaactatgtgg-3’[0151]
下游引物porv-jda：5
’‑
ggtggacgaactaattgaaacg-3’[0152]
扩增片段大小为350bp，引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。
[0153]
pcr反应体系：
[0154]
表12
[0155]
evo m-mlvrtase1μl2
×
one-step master mix10μlpedv-ms1μlpedv-ma1μl模板2μlrnase free dh2o5μl
[0156]
反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性5min后进入循环，循环参数为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延申30s；35个循环后72℃延伸10min。
[0157]
以ch09株克隆毒的f5、f10和f15代的rna为模板，利用特异性引物rt-pcr扩增porv vp6基因，结果均获得特异性片段，大小为350bp(图8)，说明克隆毒为porv。
[0158]
1.7克隆毒的间接免疫荧光检测
[0159]
将ma104细胞接种于24孔板内，待细胞长成单层弃去培养液，用含7.5μg/ml的无血清dmem洗两遍，每孔接300μl病毒液，同时设细胞对照，置于37℃二氧化碳细胞培养箱孵育
1h，弃病毒液，然后加1ml/孔含7.5μg/ml的无血清dmem；24h后弃去培养液，用pbs洗一遍，然后加入冰冷的无水乙醇，-20℃固定30min；弃固定液，pbs洗三遍，加入5％bsa 37℃封闭1h；弃封闭液加入pedv单克隆抗体37℃孵育1h；弃一抗，pbs洗三遍，加入fitc标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1h；弃二抗，pbs洗三遍，加入pbs在荧光显微镜下观察。
[0160]
ch09株间接免疫荧光检测结果
[0161]
用porv-vp6蛋白单克隆抗体作为一抗，将ch09株克隆毒的f5、f10和f15代进行间接免疫荧光试验，在荧光显微镜下观察，可见ch09株克隆毒出现绿色的特异荧光，ma104细胞对照孔内未见荧光，背景干净，结果表明所分离的病毒为porv(图9)。
[0162]
1.8克隆毒的电镜检测
[0163]
为进一步对分离病毒的形态观察，将浓缩的porv悬液经过负染后进行电镜观察，取1l病毒悬液，10000r/min，离心10min，取上清，30000r/min超速离心2h；弃上清，用4ml pbs重悬沉淀；经不同蔗糖密度梯度离心后，选取30％～40％蔗糖层脱糖后，用200μl pbs重悬，吸取25μl滴于铜网上，做负染色，置于透射电镜下观察。
[0164]
如图10，在透射电镜下可见直径大小约为70nm的病毒粒子，其形态似典型的车轮状的病毒颗粒。
[0165]
1.9 ch09株克隆毒株vp7和vp4基因的测定及生物学特性分析
[0166]
提取ch09株克隆毒株的基因组，分别利用vp7和vp4引物，扩增vp7和vp4基因全长，并进行测序；ch09株的vp4基因序列如seq id no：01所示，ch09株的vp7基因序列如seq id no：02所示，用seqman软件拼接成全基因组序列，用dnastar和mega7.0分析国内外多株不同地方porv分离株vp7和vp4基因并制作其遗传进化树。
[0167]
如图11，ch09株vp7基因核苷酸进化树结果显示，ch09株与g9基因型参考毒株处于同一分支，属于g9基因型；如图12，ch09株vp4基因核苷酸进化树结果显示，ch09株与p[23]基因型参考毒株处于同一分支，属于p[23]基因型。
[0168]
1.9 ch09株克隆毒株vp4和vp7基因与对比文件中毒株的同源性分析
[0169]
用dnaman，分析ch09株vp4和vp7基因与比对毒株(genbank的登陆mk026435～mk026445)的同源性分析，结果如图13，ch09株与对比毒株vp4基因的同源性为93.56％；ch09株与对比毒株vp4基因的同源性为93.17％。
[0170]
2.0免疫原性测定
[0171]
将ch09株病毒转瓶培养和悬浮培养的病毒液分别制备灭活疫苗免疫仔猪，于免疫后在免疫前及免疫后7日、14日、21日、35日、60日、90日、120日和150日，连同空白对照组，分别采血分离血清，检测猪轮状病毒中和抗体效价。
[0172]
向转瓶培养和悬浮培养的病毒液中分别加入甲醛至终浓度为0.25％，37℃灭活36h。将灭活好的病毒液预热至37℃，与水佐剂ims1313按体积比3：1混合后乳化。灭活前将分别将2种病毒液的病毒含量含量调整为10
8.0
tcid
50
/ml。
[0173]
将pedv、porv中和抗体均不高于1:4的母猪所产3～5日龄仔猪15头，分为3组，每组5头，第1组和第2组分别为ch09株病毒转瓶培养和悬浮培养的病毒液灭活疫苗免疫组，免疫途径为颈部肌肉接种，1.0ml/头，第3组为空白对照组。于免疫后7日、14日、21日、42日、60日、90日、120日和150日采血分离血清，测定血清中porv中和抗体，同时每组仔猪口服猪轮状病毒(保藏号cctcc no：v202191)组织毒，攻毒后连续观察10日。
[0174]
结果：1、中和抗体结果见表14，ch09株病毒悬浮培养增殖的病毒液制备的疫苗免疫仔猪的平均中和抗体为1:109.6高于转瓶培养培养增殖的病毒制备的疫苗免疫仔猪的平均中和抗体1:85.2，说明悬浮培养获得ch09株病毒液免疫原性更好。2、攻毒保护结果见表13，用ch09株病毒悬浮培养增殖的病毒液制备的疫苗组有5/5保护；转瓶培养培养增殖的病毒制备的疫苗组有3/5保护；攻毒对照组有5/5发病。
[0175]
表13 ch09株两种培养方式免疫攻毒结果
[0176][0177]
表14 ch09株两种培养方式免疫21天后中和抗体检测结果
[0178][0179]
表15 ch09株悬浮培养组灭活疫苗免疫仔猪后不同时间porv中和抗体检测结果
[0180][0181]
结论
[0182]
从疑似porv感染的病猪小肠中分离到了1株porv病毒，将这1株病毒克隆纯化后进行了一系列的研究，结果这株病毒在ma104细胞上的增殖滴度最高，对仔猪的毒力强，免疫原性好，因此确定ch09株作为猪轮状病毒灭活疫苗生产和检验用毒株。且ch09株作为猪轮状病毒灭活疫苗免疫后能在4个月内长时间保持仔猪具有较高的中和抗体水平。从表15得知，免疫组免疫前和空白对照组不同时期仔猪porv中和抗体均为阴性(中和抗体《1:8)，免疫后7日，免疫组porv中和抗体均转为阳性；免疫后14日，免疫组仔猪porv中和抗体效价在1:27～1:45之间；在免疫后21日，免疫组porv的中和抗体效价在1:96～1:128之间，平均中和抗体效价分别为1:109.6；此后进入上升期，在免疫后60日中和抗体效价达到最顶峰，免疫组porv的中和抗体效价在1:90～1:256之间，平均中和抗体效价分别为1:152.0；免疫后90日免疫组中和抗体效价在1:64～1:180之间，平均中和抗体效价分别为1:103.2；在免疫后120日免疫组仅有2/5仔猪porv中和抗体效价不低于1:64；在免疫后150日免疫组porv中和抗体效价均降至1:22及以下。
[0183]
免疫妊娠母猪所产仔猪中和抗体检测
[0184]
制备的ch09株灭活疫苗接种产前4～5周龄妊娠母猪，每批疫苗经颈部肌肉途径接种5头，每头2.0ml。免疫一次，同时设空白对照猪3头。免疫组与对照组母猪所产仔猪随机选取10头，分为2组。每组任选5头仔猪在7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、35日龄和42日龄分别进行采血分离血清，检测猪轮状病毒中和抗体效价，具体结果见表16。
[0185]
表16不同日龄仔猪母源porv中和抗体效价检测结果
[0186][0187]
从表16结果可以得知，免疫组妊娠母猪所产仔猪均在7日龄时母源抗体水平最高，之后开始缓慢下降；到21日龄时均有5/5仔猪porv母源中和抗体效价在1:64以及上，平均中和抗体效价分别为1:115.2；到28日龄(断奶后7日)时5/5仔猪porv母源中和抗体效价在1:64以及上，平均中和抗体效价分别为1:87.2；而在35日龄(断奶后14日)时中和抗体效价明显下降，只有1/5仔猪的母源抗体达到了1:64；到49日龄时仔猪母源中和抗体均为阴性。以上试验结果表明ch09株灭活疫苗免疫娠母猪后，其所产仔猪在断奶后7日(28日龄)有5/5母源抗体达到了1:64及以上。
[0188]
实施例3 猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗的制备及检验
[0189]
本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0190]
1猪流行性腹泻病毒(猪流行性腹泻病毒2a kq01株)病毒液的制备
[0191]
1.1生物反应器的细胞扩大培养
[0192]
待种子罐中细胞培养72h或96h且细胞活率为95％以上时转接细胞于生物反应器。在接种细胞前对溶氧(do)电极、ph电极、温度电极要进行校准，罐体进行高压灭菌。泵入生物反应器总体积20％的st无血清培养基，以1
×
106个/ml的细胞密度将细胞转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，ph 7.2-7.4，do 40％-60％，70rpm
±
5rpm。
[0193]
1.2病毒接种：
[0194]
当生物反应器中st细胞密度达到8
×
106个/ml，用st无血清培养基将细胞密度稀释至2.5
×
106个/ml，加入的胰酶终浓度为10ug/ml，按1moi接种猪流行性腹泻病毒2a kq01株，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，ph7.2-7.4，do 40％-60％，70rpm
±
5rpm。
[0195]
1.3病毒液收获：
[0196]
接毒后22h收获反应器的培养物，置2～8℃暂存。
[0197]
1.4病毒含量测定及无菌、外源检验：
[0198]
按现行《中国兽药典》附录进行病毒效价测定及检验，病毒含量均不低于107tcid50/ml，且应无菌生长、无规定外源。
[0199]
1.5病毒液纯化：将自然沉淀的病毒液吸取上清通过0.65μm滤器，再通过300kda的膜包浓缩。
[0200]
2猪轮状病毒(ch09株)病毒液的制备
[0201]
2.1生物反应器的细胞扩大培养
[0202]
待种子罐中细胞培养72h或96h且细胞活率为95％以上时转接细胞于生物反应器。在接种细胞前对溶氧(do)电极、ph电极、温度电极要进行校准，罐体进行高压灭菌。泵入生物反应器总体积20％的pk无血清培养基，以1
×
106个/ml的细胞密度将细胞转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，ph 7.2-7.4，do 40％-60％，50rpm
±
5rpm。培养时间为72-96小时。
[0203]
2.3.2病毒接种：
[0204]
当生物反应器中pk15细胞密度达到6
×
106个/ml，用pk15无血清培养基将细胞密度稀释至2
×
106个/ml，加入的胰酶终浓度为6ug/ml，按0.5moi接种ch09株，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，ph 7.2-7.4，do 40％-60％，50rpm
±
5rpm。
[0205]
2.3.3病毒液收获：
[0206]
接毒后24h收获反应器的培养物，置2～8℃暂存。
[0207]
2.3.4病毒含量测定及无菌、外源检验：
[0208]
按现行《中国兽药典》附录进行病毒效价测定及检验，病毒含量均不低于109tcid
50
/ml，且应无菌生长、无规定外源。
[0209]
2.3.5病毒液纯化：
[0210]
将自然沉淀的病毒液吸取上清通过0.65μm滤器，再通过300kda的膜包浓缩。
[0211]
3灭活及半成品检测
[0212]
3.1灭活：
[0213]
将纯化后的pedv和porv病毒液原液或稀释后加入灭活罐中，加入甲醛灭活，使甲醛终浓度为0.2％，边加边搅拌，混合均匀后于37℃下灭活48h，在此期间每隔2-4h搅拌一次。
[0214]
3.2无菌检验：
[0215]
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0216]
3.3灭活检验：
[0217]
取灭活后的pedv和porv病毒液按1％体积比分别接种于贴壁的vero和ma104细胞，36h后收获并反复冻融2-3次，将收获的冻融物按以上方法接种vero和ma104细胞，如此反复盲传2代，细胞应无病变。
[0218]
4猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗制备
[0219]
4.1水相制备：
[0220]
将灭活好的猪流行性腹泻病毒液和猪轮状病毒病毒液按体积比1：1混合均匀。
[0221]
4.2乳化、分装：
[0222]
将水相与水佐剂ims1313按体积比3：1混合后乳化，检测合格后定量分装、轧盖、贴签。
[0223]
5疫苗检验方法
[0224]
按照上述方法制备3批疫苗，批号分别为：20210201、20210202、20210203。
[0225]
5.1性状检验：
[0226]
3批灭活疫苗外观呈淡黄色
[0227]
5.2无菌检验：
[0228]
3批灭活疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0229]
5.3支原体检验：
[0230]
3批灭活疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。
[0231]
5.4外源病毒检验：
[0232]
3批灭活疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应为纯净毒种。
[0233]
表17 3批猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗检验结果
[0234][0235]
5.5安全试验
[0236]
5.5.1对3～5日龄仔猪的安全性试验
[0237]
选取pedv中和抗体不高于1:4和porv中和抗体不高于1:8的母猪所产3～5日龄健康仔猪20头，分成4组，每组5头，组1、组2和组3分别肌肉注射2头份3批疫苗，临床观察2周，组4不进行注射免疫为对照组，均为100％健活，未见不良反应。
[0238]
5.5.2对24～26日龄仔猪的安全性试验
[0239]
选取24～26日龄仔猪，并对其进行主要病原和相关抗体检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病病毒检测为阴性和pedv中和抗体不高于1:4和porv中和抗体不高于1:8仔猪，共计20头。将试验猪随机分成4组，每组5头。组1、组2分别肌肉注射20210201批灭活苗各1头份/头，组2免疫2周后再肌肉注射1头份/头，组3肌肉注射2头份/头，组4不进行注射免疫为对照组。观察4周。结果：免疫组1、2、3均与对照组比较，采食、饮水均未见异常，注射部位未见不良反应，100％健活。
[0240]
以上实验结果表明，本发明提供的二联灭活疫苗的安全性良好。
[0241]
5.6有效力性试验
[0242]
5.6.1猪流行性腹泻病毒部分
[0243]
5.6.1.1抗体检测法
[0244]
用3～5日龄健康易感仔猪(pedv中和抗体不高于1:4和porv中和抗体不高于1:8的母猪所产3～5日龄健康仔猪)10头，分为免疫组和对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌
肉注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的对照组，采血分离血清，检测血清中的猪流行性腹泻病毒中和抗体，结果如下表18。
[0245]
表18猪流行性腹泻病毒2a kq01株病毒制备的灭活疫苗免疫仔猪血清中抗体水平检测结果
[0246][0247]
5.6.1.2免疫攻毒法
[0248]
用3～5日龄健康易感仔猪(pedv中和抗体不高于1:4和porv中和抗体不高于1:8的母猪所产3～5日龄健康仔猪)10头，分为免疫组和攻毒对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的攻毒对照组，每头各口服猪流行性腹泻病毒强毒株，保藏号cctcc no.v202005)病毒液10.0ml(病毒含量为10
7.0
tcid
50
/ml)，在攻毒后连续观察14日，结果显示：攻毒对照组5头仔猪全部出现拉稀、呕吐等临床症状；免疫组5头仔猪没有出现拉稀、呕吐的临床症状。
[0249]
5.6.2猪轮状病毒部分
[0250]
5.6.2.1抗体检测法
[0251]
用3～5日龄健康易感仔猪(pedv中和抗体不高于1:4和porv中和抗体不高于1:8的母猪所产3～5日龄健康仔猪)10头，分为免疫组和对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的对照组，采血分离血清，检测血清中的猪轮状病毒中和抗体，结果如下表19。
[0252]
表19 ch09株病毒制备的灭活疫苗免疫仔猪血清中抗体水平检测结果
[0253][0254]
5.6.2.2免疫攻毒法
[0255]
用3～5日龄健康易感仔猪(pedv中和抗体不高于1:4和porv中和抗体不高于1:8的母猪所产3～5日龄健康仔猪)10头，分为免疫组和攻毒对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌肉注射疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的攻毒对照组，每头口服猪轮状病毒ch09株，保藏号cctcc no：v202191)组织毒液10.0ml病毒含量为100id
50
的ch09株组织毒，在攻毒后连续观察14日，结果显示：攻毒对照组5头仔猪全部出现拉稀、呕吐等临床症状；免疫组5头仔猪没有出现拉稀、呕吐的临床症状。
[0256]
[0257]