本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及一种工程化细胞，其表达特异性识别抗原的细胞表面分子和外源性的xcl1和cd40l，还涉及该工程化细胞在治疗癌症、感染或自身免疫性等疾病中的用途。
背景技术：
1、近年来，过继细胞疗法作为一种新兴的免疫疗法，已经在肿瘤治疗领域展现出巨大的优势。这种疗法通常需要先将细胞进行改造，例如通过基因编辑和/或转导等技术将细胞改造为携带嵌合抗原受体、t细胞受体等外源性蛋白，然后在体外进行扩增，并回输给患者。目前，这些疗法针对血液肿瘤已经显示出良好的疗效，但对于实体瘤而言，其功效尚不能令人满意，其中原因之一就是无法将改造后的细胞有效运输至肿瘤部位(即，免疫抑制性的肿瘤微环境)。
2、因此，仍然需要改进的细胞疗法，以抵抗肿瘤微环境的抑制作用，同时招募其他免疫效应细胞至肿瘤部位，以加强抗肿瘤效果。
技术实现思路
1、除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。
2、i.工程化细胞
3、在第一个方面，本发明提供一种新的工程化细胞，其表达特异性识别抗原的细胞表面分子以及外源性的xcl1和cd40l。
4、a.特异性识别抗原的细胞表面分子
5、术语“特异性识别抗原的细胞表面分子”是指在细胞表面表达的能够与靶分子(例如抗原)特异性结合的分子。此类表面分子一般包含能够与抗原特异性结合的抗原结合结构域、将表面分子锚定在细胞表面的跨膜结构域，以及负责信号传递的胞内结构域。常见的此类表面分子的实例包括嵌合抗原受体(car)、t细胞受体(tcr)、t细胞受体融合蛋白(tfp)、t细胞抗原耦合器(tac)或免疫动员单克隆t细胞受体(immtac)等，优选是嵌合抗原受体或t细胞受体，更优选是嵌合抗原受体。
6、术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括抗原(例如肿瘤抗原)结合结构域(例如抗体或抗原的配体)、跨膜结构域、初级信号传导结构域和任选的共刺激结构域，各个结构域之间通过接头连接。car能够以非mhc限制性的方式将t细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。在一些实施方案中，本发明的功能性外源受体是嵌合抗原受体，其包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还包含以下结构中的一个或多个：信号肽、铰链区、自杀基因、开关结构等。
7、术语“t细胞受体”或“tcr”是指响应于抗原呈递并参与t细胞活化的膜蛋白复合体。tcr的刺激由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体分子(mhc)触发，所述抗原呈递细胞将抗原肽呈递至t细胞并且结合至tcr复合体以诱发一系列胞内信号传导。tcr由分别形成异二聚体的六条肽链组成，其一般分为αβ型和γδ型。每条肽链包括恒定区和可变区，其中可变区负责结合特异性的特定的抗原和mhc分子。tcr的可变区可以包含抗原结合结构域或与抗原结合结构域可操作连接，其中抗原结合结构域的定义如下所述。
8、术语“t细胞抗原耦合器”或“tac”包括三个功能结构域：(1)肿瘤靶向结构域，包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein，darpin)或其他靶向基团；(2)细胞外结构域，与cd3结合的单链抗体，从而使得tac受体与tcr受体靠近；(3)跨膜结构域和cd4共受体的细胞内结构域，其中，细胞内结构域连接蛋白激酶lck，催化tcr复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(itam)磷酸化作为t细胞活化的初始步骤。
9、术语“t细胞受体融合蛋白”或“tfp”是指由tcr各组分衍生的重组多肽，通常由tcr亚基和与其连接的抗原结合结构域组成并在细胞表面表达。其中，tcr亚基包括至少部分tcr胞外结构域、跨膜结构域、tcr胞内信号结构域。
10、术语“免疫动员单克隆t细胞受体”或“immtac”是由工程化改造的t细胞受体(tcr)以及抗cd3的scfv组成，其中：改造后的tcr能以显著提高的亲和力特异性识别并结合肿瘤细胞表面的hla-肽复合物，并通过scfv抗体片段与cd3的相互作用促进t细胞介导的效应器功能。
11、在一些实施方案中，所述细胞表面分子包含特异性识别抗原(例如肿瘤抗原)的胞外域。在一些实施方案中，所述胞外域包含特异性结合抗原的抗体或所述抗原的配体。在一些实施方案中，所述抗原选自：alk、adrb3、akap-4、april、asgpr1、bcma、b7h3、b7h4、b7h6、bcr-abl、boris、bst2、baff-r、btla、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd70、cd72、cd79a、cd79b、cd80、cd81、cd86、cd97、cd123、cd133、cd137、cd 138、cd151、cd171、cd179a、cd300lf、cdh16、cspg4、cs1、claudin 6、claudin18.1、claudin 18.2、cea、ceacam6、cll1、c-met、caix、cxorf61、ca125、cyp1b1、cs1、elf2m、egfr、epcam、egfrviii、epha2、erg/tmprss2ets融合基因、etv6-aml、emr2、egp2，egp40、fap、far、fbp、flt3、fosl1、fcrl5、fcar、flt3、flt4、frizzled、gd2、gd3、gp100、gp130、gm3、gpc2、gpc3、gprc5d、gpr20、globoh、ghrhr、ghr、gitr、her2、her3、her-4、hmwmaa、havcr1、hpv e6,e7、hvem、hiv-1gag、hla-a1、hla-a2、il6r、il-11ra、il-13ra、igf-i受体、ltpr、lifrp、lrp5、igll1、igf1r、kit、kappa light chain、kdr、lewisy、lmp2、ly6k、lage-1a、legumain、lck、lair1、lilra2、ly75、msln、muc1、muc16、mage-a1、mage3、mad-ct-1、melana/mart1、ml-iap、mycn、muthsp70-2、ncam、ny-br-1、ny-eso-1、na17、notch-1-4、nachr、nkg2d、nkg2d配体、oy-tes1、or51e2、ox40、prss21、psca、pd1、pd-l1、pd-l2、psma、prostase、pap、pdgfr-β、pcta-1/半乳凝集素8、p53、p53突变体、prostein、plac1、panx3、pax3、pax5、ptch1、rank、rage-1、ror1、ras突变体、rhoc、ru1、ru2、robol、ssea-4、ssx2、sart3、sp17、tshr、tn ag、tgs5、tem1/cd248、tem7r、tarp、tcrα、tcrβ、tgfbr1、tgfbr2、tnfrsf4、tweak-r、tlr7、tlr9、tag72、trop-2、tie 2、trp-2、tnfr1、tnfr2、tem1、upk2vegfr、wt1、xage1、5t4、8h9、αvβ6整合素、ca9、叶酸受体α、肝配蛋白b2、酪氨酸酶、岩藻糖基gm1、邻-乙酰-gd2、叶酸受体β、多聚唾液酸、精子蛋白17、存活蛋白和端粒酶、肉瘤易位断点、人端粒末端逆转录酶/htert、雄激素受体、肠羧基酯酶、细胞周期蛋白b1、纤连蛋白、腱生蛋白、肿瘤坏死区的癌胚变体及其任意组合。优选地，所述抗原选自cd7、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd123、cd138、cd171、muc1、msln、afp、叶酸受体α、cea、psca、psma、her2、egfr、il-13ra、gd2、nkg2d、claudin18.2、ror1、egfrviii、cs1、bcma和gprc5d，更优选选自cd19、claudin 18.2、msln、gprc5d、ror1、cd7和bcma。
12、在一些实施方案中，所述功能性外源受体包含特异性识别cd19的胞外域，例如靶向cd19的抗体。本领域中已知的靶向cd19的抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，所述靶向cd19的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h与seq id no:10或19所包含的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h相同；其中所述轻链可变区包含的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l与seq id no:11或20所包含的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的cdr1-h如seq id no:4所示，cdr2-h如seqid no:5所示，cdr3-h如seq id no:6所示，所述轻链可变区包含的cdr1-l如seq id no:7所示，cdr2-l如seq id no:8所示，cdr3-l如seq id no:9所示。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的cdr1-h如seq id no:13所示，cdr2-h如seq id no:14所示，cdr3-h如seq idno:15所示，所述轻链可变区包含的cdr1-l如seq id no:16所示，cdr2-l如seq id no:17所示，cdr3-l如seq id no:18所示。
13、在一些实施方案中，所述靶向cd19的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区与seq id no:10或19具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与seqid no:11或20具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向cd19的抗体包含如seq id no:10所示的重链可变区和如seq id no:11所示的轻链可变区，或包含如seqid no:19所示的重链可变区和如seq id no:20所示的轻链可变区。
14、在一些实施方案中，所述靶向cd19的抗体与seq id no:12或21具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向cd19的抗体如seq id no:12或21所示。
15、在一些实施方案中，所述功能性外源受体包含特异性识别claudin 18.2的胞外域，例如靶向claudin 18.2的抗体。本领域中已知的靶向claudin 18.2的抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，所述靶向claudin 18.2的抗体包含vhh，其中所述vhh包含的cdr1、cdr2和cdr3与seq id no:25所包含的cdr1、cdr2和cdr3相同。在一些实施方案中，所述vhh包含的cdr1如seq id no:22所示，cdr2如seq id no:23所示，cdr3如seq id no:24所示。
16、在一些实施方案中，所述靶向claudin 18.2的抗体包含与seq id no:25具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。优选地，本发明中靶向claudin 18.2的抗体包含如seq id no:25所示的氨基酸序列。
17、在一些实施方案中，本发明的功能性外源受体是嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域和任选的一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，本发明的功能性外源受体是嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体靶向cd7、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd123、cd138、cd171、muc1、msln、afp、叶酸受体α、cea、psca、psma、her2、egfr、il-13ra、gd2、nkg2d、claudin 18.2、ror1、egfrviii、cs1、bcma、gprc5d或其任意组合，更优选靶向cd19、claudin 18.2、msln、ror1、gprc5d、cd7、bcma或其任意组合。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽和/或铰链区。
18、术语“抗原结合结构域”是指可以与抗原结合的任何结构(如抗体等)或其功能性变体。
19、在一些实施方案中，本发明中的抗原结合结构域选自抗体。术语“抗体”具有本领域技术人员所理解的最广泛的含义，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)等完整抗体，和能够表现期望的生物活性的携带一个或多个cdr序列的抗体片段或合成多肽，可为任何种类(例如igg、ige、igm、igd、iga等)或亚类(例如igg1、igg2、igg2a、igg3、igg4、iga1、iga2等)。术语“抗体片段”是指完整抗体或其变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的结合结构域(例如完整抗体的抗原可变区)。抗体片段的实例包括但不限于：fab、fab'、f(ab')2、fd片段、fd′、fv片段、scfv、二硫键-连接的fv(sdfv)、线性抗体、具有两个抗原结合位点的“双体”、单域抗体(sdab)(例如抗体的重链可变区vh、轻链可变区vl、纳米抗体vhh等)。
20、在一些实施方案中，本发明中的抗原结合结构域选自配体、受体及其功能性片段(即具有抗原结合能力的功能性片段，如胞外区)。术语“配体或受体”是指能够与抗原结合后产生相互作用的任何分子或原子。配体或受体可以是天然存在的分子，如有机或无机分子，也可以是合成的分子。
21、除非上下文明确指出，否则本发明的“抗原结合结构域”涵盖如上所述的抗体、配体及其功能性片段。因此，本发明中所述的抗原结合结构域选自完整抗体、fab、fab'、f(ab')2、fd片段、fd'、fv片段、scfv、sdfv、线性抗体、双体、sdab、配体或受体的功能性片段。
22、术语“功能性变体”或“功能性片段”是指与亲本氨基酸序列相比，含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)但保留亲本氨基酸的生物活性的变体或片段。例如，本发明中配体或受体的功能性片段一般是指配体或受体中能够与相应的免疫抑制蛋白结合的片段，如胞外区。
23、术语“重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。术语“轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
24、术语“互补决定区”或“cdr”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个cdr(例如cdr1-h、cdr2-h、和cdr3-h)，并且每个轻链可变区中存在三个cdr(cdr1-l、cdr2-l、和cdr3-l)。cdr的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种来确定，包括：kabat编号方案、chothia编号方案、imgt编号方案、aho编号方案、abm编号方案。给定cdr或fr的精确氨基酸序列可能由于选择的编号方案不同而不同，应理解，给定抗体或其区域(如其可变区)的“cdr”或“fr”涵盖由任何上述方案或其他已知方案所定义的cdr或fr，在指定的cdr或fr含有给定氨基酸序列的情况下，应理解，这样的cdr或fr还可以具有由任何上述方案或其他已知方案所定义的相应cdr或fr的序列。在本文中用于界定cdr和fr的边界的编号方案为chothia方案。
25、术语“单链抗体”或“scfv”是指包含至少一个轻链可变区(vl)和至少一个重链可变区(vh)的融合蛋白，其中所述轻链可变区和重链可变区是邻接的(例如经由接头连接)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scfv保留其来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则本文中的scfv可以以任何顺序(例如相对于多肽的n-末端和c末端)具有所述的vl和vh，scfv从n端到c端可以包含vl-接头-vh，也可以包含vh-接头-vl。术语“接头”是指连接两个分子或同一分子上的两个序列的分子序列。在一些实施方案中，接头是肽接头。优选地，接头不会不利地影响多肽的表达、分泌或生物活性。此外，接头优选地不是抗原性的并且不引发免疫应答。在一些实施方案中，接头可以是内源氨基酸序列、外源氨基酸序列(例如，富含gs的序列)或非肽化学接头。在一些实施方案中，本发明所述的接头与seq idno:41或42所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
26、术语“单域抗体”或“sdab”是指具有三个互补决定区(cdr)的单一抗原结合多肽，其包括全长抗体(例如hcab)以及其抗原结合片段(例如vh、vl、vhh)。在一些情况下，单域抗体选自骆驼源或鲨鱼源的hcab或由其工程改造而成，并且其重链可变结构域在本文中称为“vhh”。vhh从n端至c端具有以下基本结构：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4，其中fr1至fr4分别指框架区1至4，cdr1至cdr3是指互补决定区1至3。
27、术语“同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员知晓，可以使用一些算法来确定序列同一性，例如blast(altschul等(1997)nucleic acids res.25：3389-3402)、blast2(altschul等(1990)j.mol.biol.215：403-410)、smith-waterman(smith等(1981)j.mol.biol.147：195-197)和clustalw。
28、术语“跨膜结构域”是指能够使细胞表面分子在细胞表面上表达，并将抗原结合结构域锚定在细胞膜上的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当抗原结合结构域与靶标结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自以下分子：cd8α、cd4、cd28或4-1bb，或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自cd28，其与seq id no:26所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或所述跨膜结构域源自cd8α，其与seq id no:27或28所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
29、在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体在抗原结合结构域和跨膜结构域之间还包含铰链区。术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至抗原结合结构域的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合结构域提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自cd8、cd4或cd28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。优选地，所述铰链区来源于cd8α、cd28、fcγriiiα受体、igg4或igg1的铰链区，更优选来源于cd8α、cd28或igg4的铰链区。在一些实施方案中，铰链区来自cd28，其与seq idno:29所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，铰链区来自cd8α，其与seq id no:30或31所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，铰链区来自igg4，其与seq id no:32所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
30、术语“共刺激结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导如效应功能的免疫反应的蛋白质的至少一部分，其是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，包含所述共刺激分子的整个胞内区，或其功能片段。“共刺激分子”是指在与共刺激配体特异性结合，由此介导共刺激反应(例如增殖和生存)的同源结合配偶体。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域适用于本文所述的免疫抑制分子中。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla和toll配体受体。本发明的共刺激结构域包括但不限于源自以下蛋白质的胞内区：cd94、ltb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd18、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd270(hvem)、cd272(btla)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、cd357(gitr)、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim、zap70以及它们的组合。优选地，本发明car的共刺激结构域是4-1bb和/或cd28。在一些实施方案中，所述共刺激结构域来自cd28，其与seq id no:33所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述共刺激结构域来自4-1bb，其与seq id no:34或35所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
31、本发明的嵌合抗原受体还包含初级信号传导结构域。术语“初级信号传导结构域”是指在抗原-受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导的蛋白结构，其一般是t细胞受体和共受体的胞内序列。初级信号传导结构域一般包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)。本发明中的初级信号传导结构域包括但不限于源自以下蛋白质的胞内区：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体包含cd3ζ初级信号传导结构域，例如，与seq id no:36或37所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性的cd3ζ初级信号传导结构域。
32、在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含信号肽，使得当其在细胞例如t细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自b2m、cd8α、igg1、gm-csfrα等的信号肽。在一些实施方案中，可用于本发明的信号肽来自b2m，其与seq id no:38所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，可用于本发明的信号肽来自cd8α，其与seq id no:39或40所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
33、b.外源性基因
34、术语“xcl1”又称为淋巴趋化因子1，是c型趋化因子家族成员，主要由cd8+t细胞和自然杀伤细胞产生。xcl1具有独特的序列特征以及两种可相互转换的蛋白空间构象，使得xcl1有别于其他趋化因子并发挥独特的功能。xcl1特异性受体xcr1是g蛋白偶联受体家族成员，二者相互作用不仅在胸腺的阴性选择和建立自身免疫耐受中发挥重要作用，而且能启动交叉抗原呈递并介导细胞毒性免疫反应。xcl1不仅能调节免疫系统平衡，维持肠道免疫稳态，而且与多种疾病相关，如自身免疫病、肾炎、结核和人类免疫缺陷病毒感染等。
35、在一些实施方案中，本发明使用的xcl1可以是野生型xcl1、其变体或其功能性片段，所述变体或功能性片段与野生型xcl1具有相同或相似的生物学功能。具体地，本发明使用的xcl1与seq id no：1或2所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。
36、术语“cd40l”是肿瘤坏死因子(tnf)分子家族成员，其主要在活化的t细胞(包括th0、th1和th2亚型)上表达，并形成与该家族的其他成员类似的同源三聚体。此外，还发现cd40l在肥大细胞和活化的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。cd40l与抗原呈递细胞(apc)上的其受体cd40结合，这导致取决于靶细胞类型的许多作用。通常，cd40l起到共刺激分子的作用并通过apc上的mhc分子诱导与t细胞受体刺激相关的apc中的活化。通过cd40l穿过cd40发信号引发一系列事件，这些事件导致携带cd40的细胞的活化和最佳t细胞初免。更具体地，cd40l/cd40信号传导促进b细胞分化成抗体分泌细胞和记忆b细胞。另外，cd40l/cd40信号传导通过活化巨噬细胞和树突状细胞促进细胞介导的免疫，其通过自然杀伤细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的刺激促进抗肿瘤免疫应答。
37、术语“cd40l”是指全长cd40l和可溶性片段(即分泌型cd40l，例如由蛋白水解生成的cd40l的细胞外结构域形式)两者，和cd40l的单体形式以及寡聚形式(例如三聚cd40l)。例如，cd40l可以是与ncbi登录号np_000065.1所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，且具有cd40结合活性的多肽或其片段。本发明中的cd40l优选是分泌型cd40l，包含与seq id no：3或seq id no：43具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。更优选地，本发明中的cd40l具有seq id no：3或seq id no：43所示的氨基酸序列。
38、本发明中的外源性基因xcl1和/或cd40l的表达可以是组成型表达或条件型表达。在一些实施方案中，外源性基因xcl1和/或cd40l的表达是条件型表达。例如，根据需要，可以将本发明的外源基因与诱导型、阻遏型或组织特异性启动子可操作连接，从而在特定的时间或特定的组织、细胞类型内调控引入的外源基因的表达水平。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，即，仅在特定环境条件、发育条件或诱导物存在下启动转录的启动子。在另一些实施方案中，启动子是阻遏型启动子，即，在存在对阻遏型启动子具有特异性的阻遏物的情况下，外源基因在细胞中的表达被抑制或不表达。
39、在一些实施方案中，外源性基因xcl1和/或cd40l可以与定位结构域可操作连接，所述定位结构域可以将本发明的外源性基因定位在特定的细胞位置上表达，例如细胞膜等。定位结构域包括但不限于核定位信号、引导肽、跨膜结构域等。在一个实施方案中，本发明的外源性基因xcl1和/或cd40l与跨膜结构域可操作连接，从而锚定在工程化细胞的表面表达。
40、c.细胞
41、本发明还提供一种工程化细胞，表达特异性识别抗原的细胞表面分子和外源性的xcl1和cd40l。
42、在一些实施方案中，本发明的工程化细胞是工程化的免疫细胞。
43、术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导adcc和/或cdc)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是b细胞、t细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、nk细胞或nkt细胞。免疫细胞可以从多种来源获得，例如可以来自受试者(例如，从受试者的外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、肿瘤等分离而获得)，或来自体外培养的细胞系(例如jurkat、supt1、nk92等)，或从干细胞分化而来(例如，源自脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、ipsc等)。优选地，免疫细胞是t细胞或nk细胞，更优选t细胞。t细胞也可以被浓缩或纯化。t细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，cd4+cd8+t细胞、cd4+t细胞(例如th1和th2细胞)、cd8+t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、cd4-cd8-t细胞、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞、αβ-t细胞等。优选地，免疫细胞是人t细胞，可以使用本领域技术人员已知的多种技术获得t细胞，如利用ficoll从受试者的血液分离t细胞。
44、在另一些实施方案中，本发明的工程化细胞是工程化的干细胞。
45、术语“干细胞”是具有自我复制、多向分化和归巢潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的始祖细胞。在细胞分化的过程中，由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞，直至完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，其保留了亲代的特性。这部分被保留下来的未分化的原始细胞，称为干细胞，一旦需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化的细胞。本发明中所述的干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞(例如脐带血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等)以及多能干细胞(例如诱导多能干细胞ipsc等)。
46、在一些实施方案中，本发明的免疫细胞还包含至少一种内源性基因的表达被抑制或沉默，所述内源性基因选自以下：cd52、gr、tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、hla-i、hla-ii、b2m、免疫检查点基因如pd1、ctla-4、lag3和tim3。更特别地，免疫细胞中的至少tcr组分(包括tcrα、tcrβ基因)或cd3组分(包括cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ)的表达被抑制或沉默。该策略对于避免移植物抗宿主病(gvhd)特别有用。抑制或沉默基因的方法是本领域已知的，例如通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、talen核酸酶或crispr系统中的cas酶介导dna断裂，从而敲除该基因；或通过shrna、rnai等方式抑制基因表达。
47、ii.核酸和载体
48、本发明还提供一种核酸分子，其包含编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列、编码cd40l的核酸序列和编码xcl1的核酸序列。
49、术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的rna或dna，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括dna(比如dsdna、ssdna、cdna)、rna(比如dsrna、ssrna、mrna、ivtrna)，它们的组合或衍生物(比如pna)。优选地，所述核酸是dna或rna，更优选mrna。
50、本发明还提供一种载体，包含如本发明所述的核酸。其中，编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列、编码cd40l的核酸序列和编码xcl1的核酸序列可以位于一个或多个载体中。当位于一个载体中时，各核酸序列可以通过2a肽可操作连接。
51、术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。
52、载体一般包括靶向载体和表达载体。“靶向载体”是通过例如同源重组或使用特异性靶向位点处序列的杂合重组酶将分离的核酸递送至细胞内部的介质。“表达载体”是用于异源核酸序列(例如编码本发明的嵌合抗原受体多肽的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mrna的翻译的载体。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一个实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒(例如逆转录病毒、溶瘤病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒、多瘤病毒和腺相关病毒等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括bac和yac)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的dna序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常还包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，mcs)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polya)、3’utr、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。
53、iii.药物组合物和组合疗法
54、本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化细胞、核酸分子或载体作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述核酸分子、载体或工程化细胞在制备药物组合物中的用途。
55、术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.editedby gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。
56、根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。
57、根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂组合施用。
58、iv.治疗应用
59、本发明还提供一种治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据本发明所述的核酸分子、载体、工程化细胞或药物组合物。因此，本发明还涵盖所述核酸分子、载体、工程化细胞在制备治疗癌症、感染或自身免疫性疾病的药物中的用途。
60、在一些实施方案中，所述治疗方法包括向受试者施用有效量的本发明的工程化细胞和/或药物组合物。
61、术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。
62、在一些实施方案中，所述癌症是与功能性外源受体结合的靶标表达有关的癌症。例如，所述癌症包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和cns癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(gbm)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞性(sl)nhl、中间级/滤泡性nhl、中间级扩散性nhl、高级成免疫细胞性nhl、高级成淋巴细胞性nhl、高级小型非裂化细胞性nhl、大肿块病nhl)、套细胞淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、以及waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)、b细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(cml)、恶性淋巴组织增生疾病、malt淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(ptld)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的工程化细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。
63、在一些实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。
64、在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于i型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。
65、在一些实施方案中，所述方法还进一步包括向所述受试者施用一种或多种额外的化疗剂、生物制剂、药物或治疗。在该实施方案中，化疗剂、生物制剂、药物或治疗选自放射疗法、手术、抗体试剂和/或小分子和它们的任意组合。
66、下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了列举，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
1.一种工程化细胞，其表达特异性识别抗原的细胞表面分子和外源性的xcl1和cd40l。
2.根据权利要求1所述的工程化细胞，其中所述xcl1与seq id no：1或2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性；所述cd40l包含与seq id no：3或43具有至少90％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述特异性识别抗原的细胞表面分子包含特异性识别抗原的胞外域，所述细胞表面分子选自嵌合抗原受体、t细胞受体、t细胞受体融合蛋白、t细胞抗原耦合器和免疫动员单克隆t细胞受体。
4.根据权利要求3所述的工程化细胞，其中所述抗原选自：alk、adrb3、akap-4、april、asgpr1、bcma、b7h3、b7h4、b7h6、bcr-abl、boris、bst2、baff-r、btla、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd47、cd52、cd56、cd57、cd58、cd70、cd72、cd79a、cd79b、cd80、cd81、cd86、cd97、cd123、cd133、cd137、cd138、cd151、cd171、cd179a、cd300lf、cdh16、cspg4、cs1、claudin 6、claudin 18.1、claudin 18.2、cea、ceacam6、cll1、c-met、caix、cxorf61、ca125、cyp1b1、cs1、elf2m、egfr、epcam、egfrviii、epha2、erg/tmprss2ets融合基因、etv6-aml、emr2、egp2，egp40、fap、far、fbp、flt3、fosl1、fcrl5、fcar、flt3、flt4、frizzled、gd2、gd3、gp100、gp130、gm3、gpc2、gpc3、gprc5d、gpr20、globoh、ghrhr、ghr、gitr、her2、her3、her-4、hmwmaa、havcr1、hpv e6,e7、hvem、hiv-1gag、hla-a1、hla-a2、il6r、il-11ra、il-13ra、igf-i受体、ltpr、lifrp、lrp5、igll1、igf1r、kit、kappa light chain、kdr、lewisy、lmp2、ly6k、lage-1a、legumain、lck、lair1、lilra2、ly75、msln、muc1、muc16、mage-a1、mage3、mad-ct-1、melana/mart1、ml-iap、mycn、mut hsp70-2、ncam、ny-br-1、ny-eso-1、na17、notch-1-4、nachr、nkg2d、nkg2d配体、oy-tes1、or51e2、ox40、prss21、psca、pd1、pd-l1、pd-l2、psma、prostase、pap、pdgfr-β、pcta-1/半乳凝集素8、p53、p53突变体、prostein、plac1、panx3、pax3、pax5、ptch1、rank、rage-1、ror1、ras突变体、rhoc、ru1、ru2、robol、ssea-4、ssx2、sart3、sp17、tshr、tn ag、tgs5、tem1/cd248、tem7r、tarp、tcrα、tcrβ、tgfbr1、tgfbr2、tnfrsf4、tweak-r、tlr7、tlr9、tag72、trop-2、tie 2、trp-2、tnfr1、tnfr2、tem1、upk2vegfr、wt1、xage1、5t4、8h9、αvβ6整合素、ca9、叶酸受体α、肝配蛋白b2、酪氨酸酶、岩藻糖基gm1、邻-乙酰-gd2、叶酸受体β、多聚唾液酸、精子蛋白17、存活蛋白和端粒酶、肉瘤易位断点、人端粒末端逆转录酶/htert、雄激素受体、肠羧基酯酶、细胞周期蛋白b1、纤连蛋白、腱生蛋白、肿瘤坏死区的癌胚变体及其任意组合。
5.根据权利要求4所述的工程化细胞，其中所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞内结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。
6.根据权利要求5所述的工程化细胞，其中所述抗原结合结构域选自完整抗体、fab、fab'、f(ab')2、fd片段、fd'、fv片段、scfv、sdfv、线性抗体、双体、sdab和配体或受体的功能性片段。
7.根据权利要求5或6所述的工程化细胞，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：tcrα链、tcrβ链、tcrγ链、tcrδ链、cd3ζ亚基、cd3ε亚基、cd3γ亚基、cd3δ亚基、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
8.根据权利要求5-7任一项所述的工程化细胞，其中所述初级信号传导结构域选自以下蛋白质的胞内区：fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d。
9.根据权利要求5-8任一项所述的工程化细胞，其中所述共刺激结构域包含一个或多个选自以下蛋白质的胞内区：cd94、ltb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd8、cd18、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54、cd83、cd134、cd137、cd270、cd272、cd276、cd278、cd357、dap10、dap12、lat、nkg2c、slp76、pd-1、light、trim和zap70。
10.根据权利要求1-9任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞，所述免疫细胞选自t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及其任意组合。
11.根据权利要求10所述的工程化细胞，其中所述细胞选自cd4+cd8+t细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd4-cd8-t细胞、肿瘤浸润细胞、记忆t细胞、幼稚t细胞、γδ-t细胞和αβ-t细胞。
12.根据权利要求1-9任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是干细胞，所述干细胞选自胚胎干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞。
13.一种核酸分子，其包含编码特异性识别抗原的细胞表面分子的核酸序列、编码xcl1的核酸序列和编码cd40l的核酸序列。
14.一种载体，其包含权利要求13所述的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体选自质粒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、劳氏肉瘤病毒、多瘤病毒和腺相关病毒。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-12任一项所述的工程化细胞、权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的载体，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
17.权利要求1-12任一项所述的工程化细胞、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体或权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的受试者的药物中的用途。
