本发明涉及一种测试多个生物样本的方法。本发明还涉及一种用于测试多个生物样本的装置
背景技术：
1、成人干细胞、循环肿瘤细胞和反应性免疫细胞(例如对某种抗原有反应的t细胞、b细胞或nk细胞)等稀有细胞是基础与转化研究人员非常感兴趣的细胞。例如，能够对某种病原体(例如病毒)产生反应并能够产生针对该病原体特定靶分子的抗体的b细胞克隆对于生成急需的治疗性抗体具有重要价值。同样，在个性化医疗以及癌症等疾病的治疗中，人们还在寻求反应性t细胞。一旦识别并分离出反应性t细胞，就可以克隆编码相应t细胞受体的基因序列，使其对目标抗原具有亲和力，并用于生成诸如car-t细胞等基因工程t细胞。同样，循环肿瘤细胞有望在诊断癌症、预测结果、管理疗法以及发现新的癌症药物和细胞疗法方面发挥重要作用。通常，通过解离法从组织样本或液体活检中可以提取含有稀有细胞的细胞悬浮液。因此，对这些样本中的稀有细胞进行识别、分析和分离，尤其对这些细胞进行单细胞水平的分析(单细胞分析，single cell analysis，sca)，对于基础研究与转化研究、诊断和治疗应用以及生物制品和细胞疗法的生物加工、开发和制造都具有重要价值。
2、根据细胞培养研究领域的最新进展，3d细胞培养问世，它是基于三维来培养细胞，例如进行悬浮培养(无支架技术)或嵌入水凝胶和/或细胞外基质(基于支架的技术)。水凝胶和细胞外基质与其他元素一起被广泛用于基于支架的3d细胞培养。细胞和其他元素可以通过各种方式有效地嵌入水凝胶微珠等离散实体中，进行悬浮培养和成像。水凝胶微珠的形式多种多样，包括单相、多相、混合相、空心以及带或不带壳的实芯水凝胶微珠，可采用微流体、3d打印、乳化或电喷雾等多种方法制造。
3、这样就可以在3d细胞培养中培养包括稀有细胞在内的大量细胞，用于分析、诊断和治疗目的。
4、保持在悬浮状态下的嵌入水凝胶(即基于支架的细胞培养)中的细胞培养结合了基于支架的细胞培养和悬浮细胞培养的优点，因此是一种具有广泛应用前景的细胞培养模式。在许多基于此类细胞培养的处理流程中，需要能够重复识别单个离散实体。例如，在集合3d细胞培养中处理大量单细胞(包括稀有细胞)时，能够在实验过程中跟踪单个实体或细胞是非常重要的。如此，才能在大量细胞中识别、分析和分离出稀有细胞。然而，目前还无法做到在单个容器中处理大量实体和细胞的同时跟踪每个实体和细胞。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种用于测试多个生物样本的方法和装置，使用户能够根据与生物样本有关的至少一个特性唯一地识别和跟踪已被识别的单个生物样本。
2、上述目的可以通过独立权利要求的主题来实现。从属权利要求和下文的描述限定了有利实施例。
3、所提出的测试多个生物样本的方法包括以下步骤：制备多个离散实体，其中，每个离散实体均包括聚合化合物、至少一个生物样本和标志物。在成像容器中布置多个离散实体。生成多个离散实体中至少一个离散实体的至少一个第一光学读出。根据第一光学读出，确定多个离散实体中至少一个离散实体的标志物的第一表征和与生物样本相关的至少一个特性。根据与生物样本相关的至少一个特性和至少一个离散实体的标志物的第一表征，将来自成像容器的多个离散实体中的至少一个离散实体识别为目标离散实体。
4、例如通过形成由标志物和至少一种生物样本组成的水凝胶微珠，在成像容器外可以制备多个离散实体。尤其，生物样本可以是上述任何一种生物样本，例如反应性免疫细胞、反应性t细胞或肿瘤细胞。标志物可以是可光学检测的图案、结构和/或可光学检测元素的分布特性。下文将参考实施例对标志物进行具体描述。在制备多个离散实体的过程中，可能会意外产生不含生物样本和/或标志物的更多离散实体。在本文中，不将这些离散实体视为多个离散实体的一部分。将制备好的多个离散实体转移或装入成像容器，例如可以是培养皿、显微镜载玻片、微孔板或类似的合适容器。然后，从包含多个离散实体的成像容器中生成第一光学读出。尤其，光学读出可以是图像或数字图像。在获取光学读出后，根据该第一光学读出生成图像数据，并进一步处理图像数据以确定标志物的第一表征和与该生物样本相关的至少一个特性。根据标志物的第一表征和与该生物样本相关的至少一个特性，至少一个离散实体被识别为目标离散实体之一，从而例如进行进一步处理。该进一步处理可以包括从目标离散实体中检索生物样本、进一步培养和扩增、生物制品生产、生物加工、发酵、克隆基因和下游分析。下游分析可以包括基因组、转录组、蛋白质组分析、转录因子结合分析(例如chip-seq等)、dna甲基化分析、代谢组分析等。
5、在处理大量生物样本时，尤其是在成像容器等单个容器中处理大量生物样本时，很难对单个样本进行跟踪。离散实体将其中一个生物样本与标志物相结合。由于该标志物配置为对生物样本而言是唯一的，因此用户能够唯一地识别每个生物样本。因此，该方法能够使得用户在实验过程中跟踪成像容器中汇集的生物样本。尤其，该方法能够使得用户根据与生物样本相关的至少一个特性唯一地识别并跟踪已识别的目标离散实体。因此，该方法可对单细胞、细胞群、共培养物、球形体、肿瘤体或器官体进行延时实验，例如，进行基于细胞的测试，包括细胞活力测试、细胞增殖测试、细胞毒性测试、细胞衰老测试和细胞死亡测试。
6、替代地，所建议的测试多个生物样本的方法包括以下步骤：制备多个离散实体前体，每个前体均包括聚合化合物和至少一个被聚合化合物包覆的生物样本。在成像容器中布置多个离散实体前体。从多个离散实体前体创建多个离散实体，每个离散实体均包括聚合化合物、生物样本和标志物。生成多个离散实体中至少一个离散实体的至少一个第一光学读出。根据第一光学读出，确定多个离散实体中至少一个离散实体的标志物的第一表征和与生物样本相关的至少一个特性。根据与该生物样本相关的至少一个特性和至少一个离散实体的标志物的第一表征，将来自成像容器的多个离散实体中的至少一个离散实体识别为目标离散实体。
7、该替代方法与先前描述的方法的区别在于，多个离散实体是在成像容器内用多个离散实体前体制备的。除此之外，该替代方法与先前描述的方法相同，并具有相同的优点。尤其，先前描述的方法的相关特性可以用于补充该替代方法。
8、在一个优选实施例中，生物样本和标志物被聚合化合物包覆。替代地或附加地，聚合化合物还包括标志物，而且，无论是否被标志物所标记，生物样本均被聚合化合物包覆。在制备离散实体时，可对聚合化合物进行聚合，以形成离散实体。聚合聚合化合物能够实现在离散实体中培养生物样本，例如在基于支架的悬浮3d细胞培养中培养生物样本，从而结合了3d悬浮细胞培养和基于支架的细胞培养的优点。尤其，其提供了一种发挥3d悬浮细胞培养的关键优势的方式，包括：通过使用诸如旋转生物反应器、旋转瓶、搅拌槽或摇床生物反应器等搅拌容器改善混合和通风、运行连续培养基交换的可能性以及在水凝胶、细胞外基质和/或基底膜等支架中生长样本的同时进行在线处理控制的可能性，这在基质弹性、化学组合物、附着点以及旁分泌和自分泌信号方面为样本提供了更贴近生理的环境。
9、在另外的优选实施例中，该方法包括附加步骤：将多个离散实体或多个离散实体前体固定在成像容器中。通过将离散实体附着在成像容器上可以固定该离散实体，例如通过将离散实体离心至成像容器的表面。固定多个离散实体能够在该成像容器移动时，例如在生成光学读出期间，防止离散实体在成像容器中发生移动，从而更容易跟踪目标离散实体。
10、通过将该离散实体离心至成像容器的表面能够轻松地使得离散实体在成像容器中大致均匀地分布。此外，通过将该离散实体附着在功能化表面或嵌入第二水凝胶或聚合化合物中也可以固定该离散实体。上述嵌入既可以在水凝胶或聚合化合物发生聚合之前或发生聚合的同时将该离散实体放入该水凝胶或聚合化合物中，也可以先放入该离散实体，然后用合适的水凝胶或聚合化合物覆盖。水凝胶或聚合化合物可以是用于制备具有不同粘度(即凝胶浓度)的离散实体的水凝胶或聚合化合物。例如，可以使用0.8％低熔点琼脂糖制备离散实体，然后将其嵌入0.6％低熔点琼脂糖中。替代地，用于制备离散实体的基质可以不同于用于嵌入离散实体的基质。用于嵌入离散实体的基质或聚合化合物可能含有功能化成分，可通过紫外线诱导、温度诱导、化学诱导或酶诱导的裂解作用进行选择性解聚。如此，便可以控制目标离散实体的释放。
11、在另外的优选实施例中，该方法包括附加步骤：根据与生物样本相关的至少一个特性和至少一个离散实体的标志物的第一表征，从成像容器中提取多个离散实体中的至少一个离散实体。在本实施例中，可以从成像容器中取出至少一个目标离散实体，以便进一步处理。例如，可以通过抽吸的方式将该离散实体从成像容器中取出。例如，从成像容器中取出目标离散实体能够在远离其余离散实体的特定环境中进行进一步研究。
12、根据另外的优选实施例，该方法包括附加步骤：在预设时间段过后生成至少一个第二光学读出。根据该第二光学读出，确定多个离散实体中至少一个离散实体的标志物的第二表征和与生物样本相关的特性。比较第一表征和第二表征，以识别多个离散实体中的至少一个离散实体。比较根据第一光学读出确定的与生物样本相关的特性与根据第二光学读出确定的与生物样本相关的特性。在本实施例中，该方法优选地还包括附加步骤：根据比较，从成像容器中提取多个离散实体中的至少一个离散实体。在本实施例中，执行时间序列测量。在时间序列的第一时间点，生成第一光学读出，并确定与生物样本相关的特性的第一数值。在时间序列的第二时间点，生成第二光学读出，并确定与生物样本相关的特性的第二数值。在第一光学读出和第二光学读出之间，特性的值可能发生了变化。例如，可以根据第二光学读出确定特定蛋白质的表达量。
13、在另外的优选实施例中，该方法包括附加步骤：在第一光学读出和第二光学读出之间培养离散实体，尤其是培养作为离散实体一部分的生物样本。培养生物样本可以包括：用化合物、生物化合物(例如蛋白质、信号分子、核酸、抗原、新抗原、抗体)、病原体(例如病毒、细菌、寄生虫)、生物活性剂(例如crispr、rnai)、机械、电或光物理刺激进行处理。因此，本实施例实现了至少在两个时间点(即在培养步骤之前和之后的时间点)之间比较生物样本状态的处理流程。根据该第一光学读出和该第二光学读出可以确定该生物样本在处理前后的状态。此外，本实施例还可进行延时实验，例如以单细胞、细胞群、共培养物、球形体、肿瘤细胞或器官组织作为生物样本。同样，表型筛选中常用的各种基于细胞的测试也可在本实施例中进行。这种基于细胞的测试包括细胞活力测试、细胞增殖测试、细胞毒性测试、细胞衰老测试和细胞死亡测试。重要的是，以上述方式识别为目标生物样本的细胞或细胞群，可以将其提取和/或进行进一步处理。
14、在另外的优选实施例中，该方法包括附加步骤：在将多个离散实体或多个离散实体前体布置在成像容器内之前，在成像容器内布置流体或液体培养基。液体培养基可使多个离散实体或多个离散实体前体悬浮在成像容器内，从而使处理多个离散实体或多个离散实体前体更容易。此外，流体或液体培养基可以具有生物活性，以便利于生物样本的培养。液体培养基可以包括细胞培养基(例如dmem)、缓冲液(例如pbs、pbdt)或合成水凝胶。液体培养基还可以包括复杂的混合物，例如天然衍生的混合物，诸如jellageltm、基质胶和胶原蛋白。
15、在另外的优选实施例中，该方法包括附加步骤：在液体培养基顶部布置保护层。该保护层可以保护液体培养基和离散实体，防止其干燥或受到环境影响。该保护层可以由上文提到的与液体培养基有关的任何物质形成。可以形成一个以上的保护层。该保护层和该液体培养基可以是具有不同性质(例如密度和粘度)的同一种物质。保护层和液体培养基之间的差别尤其在于浓度，例如0.6％的低熔点琼脂糖会非常柔软，而2％的低熔点琼脂糖则相对较硬。生物组织的弹性模量差别很大，例如从骨基质、软骨、结缔组织到子宫内膜都有差别。生成各种具有良好生物相容性的材料的一种方法是，对含有这些组织特有的某些关键细胞外基质组分的生物启发的组合物进行利用。此类蛋白质可以例如为血栓软蛋白、腱生蛋白、comp、胶原蛋白、胶原蛋白iv，此外还可以使用透明质酸和糖基化基团。具有良好生物相容性的凝胶也可以来源于组织工程领域用于3d打印的生物墨水，从而用作液体培养基或保护层。
16、在另外的优选实施例中，所述方法包括附加步骤：向液体培养基中添加试剂，来形成凝胶或聚合化合物，以包覆多个离散实体或多个离散实体前体。通过形成凝胶或聚合化合物，可以固定多个离散实体，从而例如在处理成像容器时，防止单个离散实体发生移动。通过使用添加到液体培养基中的各种交联剂或单体上的反应基团进行官能化和/或交联可以形成用于包覆多个离散实体或多个离散实体前体的基质。
17、在另外的优选实施例中，所述方法包括附加步骤：提供对成像容器中与生物样本有关的特性敏感的化合物，尤其生物化合物。与生物样本有关的特性可以根据化合物的反应来确定。例如，该化合物可包括专门的报告细胞、fireplex颗粒或报告阵列，它们被配置为捕获目标分析物(诸如分泌蛋白)，以使它们成为使用适当的检测和标记试剂可检测的。优选地，将化合物作为一层、尤其单层提供于成像容器的底部。因此，该方法可以包括附加步骤：尤其在将多个离散实体或多个离散实体前体布置在所述成像容器内之前，在成像容器底部制备上述层。提供化合物作为离散实体本身的一部分，可能会使得化合物在离散实体中分布不均，进而影响生物样本。与此相反，以层的形式提供化合物可确保化合物均匀地分布在生物样本周围。在一个示例中，生物样本可以为克隆细胞，与生物样本相关的所需特性可以为特定单克隆抗体(mab)的分泌物。化合物配置为例如通过包含原生抗原能够与特定单克隆抗体的存在发生反应。尤其，该化合物被配置为以可光学检测的方式与特定单克隆抗体的存在发生反应。例如，该特定单克隆抗体的存在可改变化合物的光学性质，诸如透明度、颜色或荧光信号，例如亮度、光谱变化、荧光寿命。光学性质的变化可以定位在各个目标生物样本所处的位置处。因此，可以通过第一光学读出和/或第二光学读出检测到特定单克隆抗体的存在。一旦检测到特定单克隆抗体的存在，就可以将分泌该单克隆抗体的生物样本中的离散实体标记为目标离散实体。接着，可以提取或进一步处理该目标离散实体。
18、在另外的优选实施例中，每个标志物均包括发光微珠、非荧光微珠、发光纳米尺和染料中的至少一种。微珠和纳米尺可以发荧光或磷光的。如果标志物包括荧光或非荧光微珠，则可以使用不同种类的微珠，这些不同种类的微珠可以包括大小(直径)不同、形状不同、发射特性(荧光)(诸如不同发射光谱或不同荧光寿命)不同的微珠。标志物可以分布在离散实体的表面、嵌入聚合化合物中、附着在生物样本上和/或嵌入生物样本中。在本实施例中，对标志物进行快速、非破坏性和非接触式检测均是可以的。优选地，可以对标志物进行调整，从而例如，如下文进一步详细说明的那样，通过在离散实体中或离散实体处以三维方式随机布置的但静态分布的发光微珠来实现对多个离散实体中至少一个离散实体的唯一识别。标志物的上述元素可以很容易地以极高的采集速度读出，因而非常适合分割或特性提取。此外，通过图像处理，可以很容易地从图像数据中去除标志物的元素。这一点是非常有利的，否则标志物可能会阻碍对所含生物样本的观察。
19、在另外的优选实施例中，每个标志物均包括至少一个具有定向组分的元素，尤其纳米尺、杆状纳米结构或细长微珠。定向组分也可以是具有单个中心轴(诸如纵轴)的任何其他合适对象，并且可通过单个中心轴识别该对象的方向。
20、在另外的优选实施例中，每个标志物均包括三维图案。尤其，标志物可以通过蚀刻生成，尤其光刻法、多光子光刻法或双光子蚀刻法。三维图案可在形成离散实体后生成。使用多光子蚀刻法可以生成类似于堆叠条形码的三维图案。与二维码相比，这种三维图案所含的信息内容明显更多，并且允许生成大量的唯一码。三维图案还可以在图案中存储与样本来源、实验和/或用户有关的附加信息，从而直接存储在离散实体中。值得注意的是，这种三维图案在很长一段时间内都非常稳定，不仅在本文所述的处理流程中具有显著优势，而且在生物样本库中也非常有价值。
21、本发明还涉及一种用于测试大量生物样本的装置，该装置配置为执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。该装置包括：成像容器，配置为接收多个离散实体和/或多个离散实体前体，以及光学读出单元，配置为执行多个离散实体的至少一个光学读出。控制单元配置为根据光学读出单元执行的至少一个光学读出，至少确定多个离散实体中的每个离散实体的标志物的第一表征和与生物样本相关的至少一个特性。尤其，控制单元为装置的一部分。替代地，控制单元可以布置成远程于该装置。远程布置的控制单元可通过计算机网络与装置的其他部分相连。
22、该装置与所保护的方法具有相同的优点。尤其，与方法相关的从属权利要求中的特征还可以用于补充该装置。此外，本文所述的与装置相关的功能还可用于补充所述方法。
23、本发明还涉及一种计算机程序产品，其包括程序代码，当在处理器上运行时，该程序代码能够使上述装置执行上述方法之一。
24、计算机程序产品具有与上述方法和装置相同的优点。尤其，从属权利要求中针对所述方法的特征可以补充所述计算机程序产品。
25、本发明还涉及一种包括上述计算机程序的计算机可读介质。
1.一种测试多个生物样本(108)的方法，包括以下步骤：
2.一种测试多个生物样本(108)的方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物样本(108)和所述标志物(110)被所述聚合化合物包覆；和/或，其中，所述聚合化合物包括标志物(110)，而且所述生物样本(108)无论被或未被所述标志物(110)所标记均被所述聚合化合物包覆。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括附加步骤：将所述多个离散实体(100、1800)或所述多个离散实体前体固定在所述成像容器(102)中。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括附加步骤：根据与所述生物样本(108)相关的所述至少一个特性和所述至少一个离散实体(100，1800)的所述标志物(110)的所述第一表征，从所述成像容器(102)中提取所述多个离散实体(100，1800)中的至少一个离散实体(100，1800)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括附加步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，包括附加步骤：在所述第一光学读出和所述第二光学读出之间培养所述离散实体(100，1800)，尤其是培养作为所述离散实体(100，1800)一部分的所述生物样本(108)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括附加步骤：在将所述多个离散实体(100，1800)或所述多个离散实体前体布置在所述成像容器(102)内之前，在所述成像容器(102)内布置流体或液体培养基(106，2000)。
9.根据权利要求8所述的方法，包括附加步骤：在所述液体培养基(106，2000)上布置保护层(500)。
10.根据权利要求8或9所述的方法，包括附加步骤：向所述液体培养基(106，2000)中添加试剂，来形成凝胶或聚合化合物(1300，1304)，以包覆所述多个离散实体(100，1800)或所述多个离散实体前体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括附加步骤：提供化合物(1802)，尤其生物化合物，所述化合物对所述成像容器(102)中与所述生物样本(108)有关的所述特性敏感，其中与所述生物样本(108)有关的所述特性是根据所述化合物的反应确定的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述成像容器(102)的底部提供所述化合物作为层(900)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，每个标志物(110)均包括发光微珠、非荧光微珠、纳米尺和染料中的至少一种。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，每个标志物(110)均包括至少一个具有定向组分的元件，尤其纳米尺、杆状纳米结构或细长微珠。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，每个标志物(110)均包括三维图案。
16.一种用于测试大量生物样本(108)的装置(2100)，其配置为执行根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述装置(2100)包括：
17.一种计算机程序产品，包括程序代码，当在处理器上运行时，所述程序代码能够使根据权利要求16所述的装置(2100)执行根据权利要求1至15中任一项所述的方法。
18.一种包括权利要求17所述的计算机程序产品的计算机可读介质。
