本发明属于生物医药领域，具体涉及一种融合疟原虫sra蛋白的巨噬细胞的制备与抗肿瘤应用。
背景技术：
1、癌症严重威胁全人类的生命健康。目前癌症治疗的常规方法包括手术，放射治疗、化学药物治疗和免疫治疗。由于临床症状的隐匿性，仅少数早期癌症患者能通过手术治愈，而大多数中晚期患者采用常规治疗难以取得理想效果。传统的放疗和化疗难以根除晚期癌症且易导致副作用等多种弊端。免疫治疗目前是治疗癌症的重要手段。
2、肿瘤微环境是肿瘤细胞和免疫系统相互作用的重要部位，其对肿瘤的发生、发展和预后起着决定性作用。巨噬细胞是肿瘤微环境中最重要的组成部分之一，其与肿瘤细胞的相互作用可以影响肿瘤进展。经典途径激活的m1型巨噬细胞能够分泌炎性因子和no等抑制细胞增殖，具有抗肿瘤作用。而替代途径激活的m2型巨噬细胞分泌抗炎因子参与免疫抑制，发挥促肿瘤作用。肝癌肿瘤微环境中的巨噬细胞往往分化为m2型。研究证明，m2型巨噬细胞的大量浸润与肝癌患者的不良预后密切相关，而m1型巨噬细胞能分泌促炎因子，抑制肝癌进展。研究发现，疟原虫感染能促进宿主血清中促炎因子的分泌并激活多种免疫细胞尤其是m1型巨噬细胞。因此疟原虫在肿瘤治疗方面具有重要的应用价值。目前用间日疟原虫免疫疗法治疗晚期肝癌的临床试验已在我国获得批准。为了确保疗效和治疗的安全性，应用间日疟原虫中参与调控肿瘤免疫微环境从而抑制肝癌进展的功能组份是疟原虫抗肿瘤免疫疗法的理想选择。
3、间日疟原虫表面相关抗原（pvsra， plasmodium vivax surface-relatedantigen）是一种由间日疟原虫裂殖子向受染红细胞膜输出的蛋白，可以与宿主体内免疫细胞互作引起机体较强的免疫应答，并可促进巨噬细胞向m1型极化。通过病毒转染获得稳定表达间日疟原虫sra蛋白的巨噬细胞，这种疟原虫基因修饰的巨噬细胞显著向m1型极化且具有更强的抗肿瘤作用。
4、疟原虫疗法具有广阔的应用前景，有研究证实了其对一些晚期癌症具有良好的治疗效果，但目前还未有任何关于用疟原虫基因修饰的巨噬细胞治疗肝细胞癌的研究。疟原虫基因修饰的巨噬细胞既可以单独用于治疗，也可以联合其他治疗方式，在肝细胞癌的免疫治疗方面具有很高的应用价值。
技术实现思路
1、本发明的主要目的在于提供一种融合间日疟原虫sra蛋白的巨噬细胞的构建方法，所述基因修饰的巨噬细胞相较普通的巨噬细胞对肝细胞癌具有更强的抑制作用。本发明操作简单，经过改造的巨噬细胞具有较好的生物相容性且能在血液循环中停留较长时间，在肝细胞癌的治疗中有很好的应用前景。
2、本发明将间日疟原虫sra蛋白连接到病毒载体，用于感染巨噬细胞，以获得融合表达疟原虫蛋白的巨噬细胞。
3、在本发明的一种实施方式中，所述间日疟原虫sra蛋白的gene id为pvx_084970，所述间日疟原虫sra蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、在本发明的一种实施方式中，编码所述间日疟原虫sra蛋白的氨基酸序列如seqid no.2所示。
5、本发明提供了一种制备融合间日疟原虫sra蛋白的巨噬细胞的方法，所述方法具体包括如下步骤：
6、（1）从间日疟原虫基因组dna中通过pcr扩增 pvsra基因，将扩增的目的基因连接到病毒载体上；
7、（2）将病毒载体和包装质粒共转染到病毒包装细胞中，48-72h后收集培养液上清并浓缩；
8、（3）用病毒浓缩液感染巨噬细胞，通过筛选即得到融合间日疟原虫蛋白的巨噬细胞。
9、在本发明的一种实施方式中，所述病毒载体优选为pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro。
10、在本发明的一种实施方式中，所述病毒包装细胞优选为hek293t细胞。
11、在本发明的一种实施方式中，所述病毒浓缩方法优选为使用病毒浓缩试剂盒。
12、在本发明的一种实施方式中，所述巨噬细胞优选为raw264.7细胞。
13、在本发明的一种实施方式中，所述筛选方法优选为为药物筛选。
14、本发明提供了所述巨噬细胞在抗肿瘤中的应用。
15、在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤优选为肝细胞癌。
16、在本发明的一种实施方式中，所述巨噬细胞可抑制肝细胞癌进展。
17、在本发明的一种实施方式中，所述应用包括单独应用或与其他治疗方式联合应用。
18、有益效果：本发明首次通过动物实验在体内验证了融合间日疟原虫sra蛋白的巨噬细胞的抗肝细胞癌作用。所述基因修饰的巨噬细胞相较普通巨噬细胞具有更显著的抑癌作用，为肝癌的免疫疗法提供新思路，具有广阔的应用前景。
1.一种融合间日疟原虫sra蛋白的巨噬细胞的制备与应用，其特征在于，所述间日疟原虫蛋白的gene id为pvx_084970；所述间日疟原虫蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.所述间日疟原虫蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.制备融合间日疟原虫sra蛋白的巨噬细胞的方法，其特征在于，将表达所述蛋白的病毒转染到巨噬细胞中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒载体包括但不限于慢病毒载体。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒包装细胞包括但不限于hek293t细胞。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述病毒浓缩方法可以是超速离心或使用病毒浓缩试剂盒。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述巨噬细胞包括但不限于raw264.7细胞。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述筛选方法可以为药物筛选或流式分选。
10.权利要求1所述巨噬细胞在制备抗肿瘤产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品可抑制肿瘤进展。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于药物。
