本发明属于医药，具体地，涉及一种阴离子脂质纳米佐剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、恶性肿瘤和多种传染性疾病严重威胁人类生命健康，亟需开发安全有效的治疗手段以提高对恶性肿瘤和传染性疾病的防治效果。通过激发患者自身的免疫反应可实现对多种恶性肿瘤和传染性疾病的有效防治。通过增强疾病相关抗原或特异性抗原的加工呈递，激活抗原特异性免疫应答，可高效发挥机体免疫系统对肿瘤细胞或病原体的清除和杀伤作用。疫苗发挥作用依赖高效的疾病抗原和免疫佐剂，进一步地，通过纳米制剂有望实现抗原和佐剂的精准递送，提高抗原提呈细胞(antigen presenting cells，apcs)的免疫效率。具有高度免疫原性的抗原被apcs如树突状细胞(dendritic cell，dc)识别，与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)分子结合，呈递到apcs表面，与cd4+或cd8+t细胞表面的受体结合，激活免疫应答。目前，疫苗的研发仍面临多种挑战。第一，apcs对抗原的加工呈递受抗原体内递送效率的限制，apcs无法有效激活及完成抗原呈递；第二，亟需开发高效的免疫佐剂，以进一步提升抗原的免疫效果。佐剂可以减少疫苗接种次数，提高抗原的稳定性，激发持久高强度的免疫应答。然而，目前上市批准的免疫佐剂数量有限，无法满足对多种疾病免疫防治的需求。因此，亟需开发一种满足多种疾病免疫防治需求的免疫佐剂。
技术实现思路
1、针对上述问题，申请人提供了一种特定处方的阴离子脂质纳米佐剂，其具有激活免疫系统，增强免疫反应的免疫佐剂的效应，可以用于疫苗的联合给药。
2、本发明的第一方面，提供了一种阴离子脂质纳米佐剂，所述阴离子脂质纳米佐剂为阴离子脂质纳米粒，所述阴离子脂质纳米粒含有阴离子脂质、peg-脂质、胆固醇类化合物和辅助型脂质；其中，所述阴离子脂质纳米佐剂的表面电势为-5mv至-45mv。
3、在另一优选例中，所述阴离子脂质纳米佐剂的表面电势为-10mv至-45mv；优选为-20mv至-40mv；更优选为-30mv至-35mv。
4、在另一优选例中，所述的阴离子脂质、peg-脂质、胆固醇类化合物和辅助型脂质复合形成膜状颗粒。
5、在另一优选例中，所述的膜状颗粒具有中空结构。
6、在一优选例中，所述阴离子脂质选自下组：dspa、dppa、dmpa、dlpa、dopa，或其组合；
7、所述胆固醇类化合物选自下组：cho-hp、维生素d2、维生素d3、β-谷甾、芸苔甾醇、麦角甾醇，或其组合；
8、所述辅助型脂质选自下组：dope、dspe、dppe、dmpe、dlpe，或其组合；和/或
9、所述peg-脂质选自下组：dmg-peg、dsg-peg、dspe-peg、dspe-mpeg、dppe-mpeg，或其组合。
10、在另一优选例中，其中peg的分子量为400～20000，较佳地500～10000，更佳地1000～5000，最佳地2000～3000。
11、在另一优选例中，所述阴离子脂质和peg-脂质的摩尔比为(0.1～80):1；优选地(0.2～70):1；更优选地(0.5～60):1；最优选地(0.5～50):1。
12、在一优选例中，所述胆固醇类化合物和peg-脂质的摩尔比为(35～45):1；优选地(37～43):1；更优选地(38～42):1；最优选地(39～41):1。
13、在另一优选例中，所述辅助型脂质和peg-脂质的摩尔比为(1～100):1；优选地(2～80):1；更优选地(3～70):1；最优选地(5～60):1。
14、在另一优选例中，所述阴离子脂质、胆固醇类化合物、辅助型脂质和peg-脂质的摩尔比为(0.1～80):(35～45):(1～100):1；优选地(0.2～70):(37～43):(2～80):1；更优选地(0.5～60):(38～42):(3～70):1；最优选地(0.5～50):(39～41):(5～60):1。
15、在另一优选例中，所述阴离子脂质和胆固醇类化合物的摩尔比为(0.01～1.5):(0.9～1.1)，较佳地(0.02～1.5):(0.9～1.1)。
16、在另一优选例中，所述辅助型脂质和胆固醇类化合物的摩尔比为(0.1～1.8):(0.9～1.1)，较佳地(0.2～1.5):(0.9～1.1)。
17、在另一优选例中，所述peg-脂质和胆固醇类化合物的摩尔比(0.005～0.05):(0.9～1.1)，较佳地(0.01～0.03):(0.9～1.1)。
18、在另一优选例中，所述阴离子脂质的摩尔数为0.01～1.5，较佳地0.02～1.5，按胆固醇类化合物的摩尔数为1计算。
19、在另一优选例中，所述辅助型脂质的摩尔数为0.1～1.8，较佳地0.2～1.5，按胆固醇类化合物的摩尔数为1计算。
20、在另一优选例中，所述peg-脂质的摩尔数为0.005～0.05，较佳地0.01～0.03，按胆固醇类化合物的摩尔数为1计算。
21、在另一优选例中，所述阴离子脂质纳米佐剂的平均水化粒径为100～500nm；优选为150～400nm；更优选为200～300nm。
22、在一优选例中，所述阴离子脂质纳米佐剂的多分散系数为0.2～0.8；优选为0.2～0.6；更优选为0.2～0.5或0.2～0.4。
23、在另一优选例中，所述阴离子脂质纳米佐剂基本上不含有或含有两性脂质、以及基本上不含有或含有阳离子脂质。
24、在另一优选例中，在所述阴离子脂质纳米佐剂中，两性脂质的含量≤0.01，按胆固醇(cho-hp)类化合物的摩尔数为1计算。
25、在另一优选例中，在所述阴离子脂质纳米佐剂中，阳离子脂质的含量≤0.01，按胆固醇(cho-hp)类化合物的摩尔数为1计算。
26、本发明的第二方面，提供了一种根据本发明第一方面所述的阴离子脂质纳米佐剂的制备方法，包括以下步骤：
27、s1.将阴离子脂质、peg-脂质、胆固醇类化合物和辅助型脂质溶于有机溶剂中，减压旋蒸干燥，形成薄膜；
28、s2.向步骤s1所得的薄膜在水相中进行水化和均质，从而获得如本发明第一方面所述阴离子脂质纳米佐剂。
29、在另一优选例中，在步骤s2中，向步骤s1所得的薄膜添加缓冲液或纯水，并水化和均质，从而获得所述阴离子脂质纳米佐剂。
30、在另一优选例中，所述薄膜与水相的比例为5-10mg(干重)：1～10ml。
31、在另一优选例中，步骤s1中，还包括步骤：置于56℃以上5～15s；优选地，置于56℃以上热水中水浴5～15s。
32、在另一优选例中，步骤s2中，所述水化包括步骤：在56℃以上搅拌0.5～3h；优选地，在56℃以上热水中水浴搅拌0.5～3h。
33、在另一优选例中，步骤s2中，所述均质包括步骤：在室温下超声均质5次以上，其中超声时间1～3s，间隔时间2～4s，超声功率100～300w。
34、在一优选例中，步骤s1中，所述有机溶剂选自下组：三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇，或其组合。
35、在一优选例中，步骤s1中，所述减压旋蒸干燥的温度为20～80℃；优选为25～75℃；更优选为30～60℃。
36、在另一优选例中，步骤s1中，所述减压旋蒸干燥的时间为1～15min；优选为1～12min；更优选为2～7min。
37、本发明的第三方面，提供了根据本发明第一方面所述的阴离子脂质纳米佐剂在制备疫苗组合物中的用途。
38、在另一优选例中，所述的疫苗组合物用于防治选自下组的疾病：肿瘤、传染性疾病。
39、本发明的第四方面，提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有(a)免疫原或编码所述免疫原的核酸分子、(b)权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂、和(c)药学上可接受的载体。
40、在另一优选例中，所述的疫苗组合物基本上不含有或含有两性脂质、以及基本上不含有或含有阳离子脂质。
41、在另一优选例中，所述的疫苗组合物中，在所述阴离子脂质纳米佐剂中，两性脂质的含量≤0.01％(较佳地≤0.001％，或为0)，按疫苗组合物的总重量(干重)计。
42、在另一优选例中，所述的疫苗组合物中，在所述阴离子脂质纳米佐剂中，阳离子脂质的含量≤0.01％(较佳地≤0.001％，或为0)，按疫苗组合物的总重量(干重)计。
43、在另一优选例中，所述的疫苗组合物用于防治选自下组的疾病：肿瘤、传染性疾病。
44、在另一优选例中，所述的免疫原包括蛋白、多肽、表位肽、病毒颗粒、vlp。
45、在另一优选例中，所述的编码所述免疫原的核酸分子包括mrna、质粒、病毒载体、或其组合。
46、本发明的第五方面，提供了根据本发明第一方面所述的阴离子脂质纳米佐剂在制备用于增强树突状细胞成熟的比例的制剂中的用途。
47、本发明的第六方面，提供了根据本发明第一方面所述的阴离子脂质纳米佐剂在制备用于促进树突状细胞对抗原的摄取和加工的制剂中的用途。
48、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
1.一种阴离子脂质纳米佐剂，其特征在于，所述阴离子脂质纳米佐剂为阴离子脂质纳米粒，所述阴离子脂质纳米粒含有阴离子脂质、peg-脂质、胆固醇类化合物和辅助型脂质；其中，所述阴离子脂质纳米佐剂的表面电势为-5mv至-45mv。
2.根据权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂，其特征在于，所述阴离子脂质选自下组：dspa、dppa、dmpa、dlpa、dopa，或其组合；
3.根据权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂，其特征在于，所述胆固醇类化合物和peg-脂质的摩尔比为(35～45):1；优选地(37～43):1；更优选地(38～42):1；最优选地(39～41):1。
4.根据权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂，其特征在于，所述阴离子脂质纳米佐剂的平均水化粒径为100～500nm；优选为150～400nm；更优选为200～300nm。
5.根据权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂，其特征在于，所述阴离子脂质纳米佐剂的多分散系数为0.2～0.8；优选为0.2～0.6；更优选为0.2～0.5或0.2～0.4。
6.一种根据权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述有机溶剂选自下组：三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇，或其组合。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述减压旋蒸干燥的温度为20～80℃；优选为25～75℃；更优选为30～60℃。
9.根据权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂在制备疫苗组合物中的用途。
10.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有(a)免疫原或编码所述免疫原的核酸分子、(b)权利要求1所述的阴离子脂质纳米佐剂、和(c)药学上可接受的载体。
