一种ClO-GSH氧化还原可逆响应的近红外分子探针及其制备方法与应用

一种clo-/gsh氧化还原可逆响应的近红外分子探针及其制备方法与应用
技术领域
1.发明属于近红外分子探针技术，具体涉及一种clo-/gsh氧化还原可逆响应的近红外分子探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.肾缺血再灌注损伤常见于肾脏移植手术、肾脏外伤手术、体外冲击波碎石术等情况，是导致急性肾功能衰竭的主要原因之一。目前临床上缺乏有效的早期诊断，大多数的病人都是在疾病已经发生和发展后才被诊断出来，这导致肾脏基础疾病进一步恶化，极大增加了病人的死亡率。因此，对于肾缺血再灌注损伤的早期诊断具有重要的临床意义。
3.肾组织在缺血再灌注过程中会产生大量的活性氧(ros)，超过了机体的清除能力，ros因其极易与各种细胞结构成分发生反应而导致细胞氧化损伤。次氯酸根离子(clo-)作为重要的ros之一，是一种高效、快速的抗微生物剂。对于生物体而言，内源性clo-是由髓过氧化物酶(mpo)催化过氧化氢(h2o2)和氯离子(cl-)的氧化反应产生的。然而，过量的clo-则会导致各种疾病的发生和恶化。谷胱甘肽(gsh)是体液中clo-的主要清除剂，保护细胞免受损害。它作为丰富的非蛋白硫醇，在维持细胞动态氧化还原环境和修复或对抗细胞死亡或功能障碍的氧化损伤方面发挥着重要作用。
4.目前，国内外研究开发了可分别检测活细胞中氧化物clo-和还原物gsh的探针，并取得了巨大的成功。但大多数探针不能通过一个响应信号同步监测氧化物和还原物，因此很难揭示真实的氧化还原状态。clo-/gsh是活细胞氧化还原偶联物的重要代表，细胞氧化还原状态的稳态在各种生理和病理过程中起着不可缺少的作用，因此，clo-/gsh氧化还原循环检测探针的设计对生物成像领域具有重要意义，有助于开发clo-/gsh之间氧化还原循环的可视化或监控平台。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本技术提供了一种clo-/gsh氧化还原可逆响应的近红外光声探针，并提供了其制备方法与应用。
6.本发明的技术关键点在于：
7.本发明合成了一种以氮杂氟硼二吡咯为母核的新修饰结构的近红外分子探针。其制备方法是以3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛和4-甲氧基苯乙酮为初始原料，经过4步反应成功合成azabdp-dioh。首先，3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛和4-甲氧基苯乙酮经羟醛缩合得到化合物1；在二乙胺存在的条件下，化合物1经迈克尔加成反应引入硝基甲烷进一步得到化合物2；再以醋酸铵为氮源，在乙醇回流的条件下进行一步成环反应，得到氮杂二吡咯烯；最后，氮杂二吡咯烯经三乙胺和三氟化硼乙醚的共同作用得到终产物azabdp-dioh。
8.本发明通过以下技术方案实现发明目的：
9.本发明的第一个目的是提供一种clo-/gsh氧化还原可逆响应的近红外分子探针
azabdp-dioh，所述近红外分子探针azabdp-dioh的结构式如式(ⅰ)所示：
[0010][0011]
进一步的，所述近红外分子探针azabdp-dioh能对clo-进行特异性氧化响应，反应生成azabdp-dio，所述azabdp-dio能对gsh进行特异性还原响应，反应生成azabdp-dioh，
[0012]
所述azabdp-dio结构式为：
[0013]
本发明的第二个目的是提供前述近红外分子探针azabdp-dioh的制备方法，反应路线如下所示：
[0014][0015]
所述方法包括以下步骤：
[0016]
(1)3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛和4-甲氧基苯乙酮经羟醛缩合反应得到化合物1；
[0017]
(2)在二乙胺存在的条件下，化合物1经迈克尔加成反应引入硝基甲烷进一步得到化合物2；
[0018]
(3)以醋酸铵为氮源，将化合物2在乙醇回流的条件下进行一步成环反应，得到氮杂二吡咯烯；
[0019]
(4)氮杂二吡咯烯经三乙胺和三氟化硼乙醚的共同作用得到终产物azabdp-dioh。
[0020]
所述化合物1结构式为：
[0021]
所述化合物2结构式为：
[0022]
进一步的，所述方法具体操作为：
[0023]
(1)将3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛和4-甲氧基苯乙酮溶于乙醇中后加入氢氧化钾，在室温下搅拌，搅拌时间为0.5-1.5h，进行羟醛缩合反应，过滤沉淀产物，用乙醇洗涤并减压干燥，得到浅黄色固体化合物1；优选的，搅拌时间为1h；
[0024]
(2)将化合物1、硝基甲烷和二乙胺溶于甲醇加热回流，加热回流时间为8-12h，进行迈克尔加成反应，室温下冷却后，在真空中去除溶剂并用水清洗；有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到黄色油液化合物2；优选的，加热回流时间为10h；
[0025]
(3)将化合物2和醋酸铵溶于乙醇中回流，回流时间为8-10h，进行一步成环反应，冷却至室温并浓缩；用乙醇洗涤和过滤沉淀物，以获得蓝黑色固体产物氮杂二吡咯烯；该产物可直接使用，无需纯化；优选的，回流时间为9h；
[0026]
(4)向甲苯中的氮杂二吡咯烷中添加三乙胺和三氟化硼二乙醚；加热搅拌，加热搅拌温度为55-65℃，加热搅拌时间为1.5-2.5h；冷却至室温后，在真空下去除溶剂；残渣用乙醇洗涤和过滤，得到红色固体，即为近红外分子探针azabdp-dioh；优选的，加热搅拌温度为60℃，加热搅拌时间为2h。
[0027]
进一步的，步骤(1)中3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛、4-甲氧基苯乙酮、氢氧化钾三者物质的量比为2：2：5；每0.01mol 4-甲氧基苯乙酮对应8-12ml乙醇，优选的，每0.01mol 4-甲氧基苯乙酮对应10ml乙醇。
[0028]
进一步的，步骤(2)中每1mmol化合物1对应0.4-0.6ml硝基甲烷；硝基甲烷、二乙胺、甲醇体积比为1：1：3；优选的，步骤(2)中每1mmol化合物1对应0.5ml硝基甲烷。
[0029]
进一步的，步骤(3)中化合物2与醋酸铵的摩尔比为1：20；每1mmol化合物2对应15-25ml乙醇；优选的，每1mmol化合物2对应20ml乙醇。
[0030]
进一步的，步骤(4)中甲苯中的氮杂二吡咯烷、三乙胺、三氟化硼二乙醚体积比为50：2：3，其中氮杂二吡咯烷的浓度为2.3mm。
[0031]
本发明的第三个目的是提供前述的近红外分子探针azabdp-dioh在同时检测活细胞中clo-和gsh中的应用，所述应用能够获得的信息包括(1)至(3)中的至少一个：
[0032]
(1)定性检测活细胞中clo-、gsh的含量变化趋势；
[0033]
(2)定量检测活细胞中clo-和/或gsh的含量；
[0034]
(3)评价肾缺血再灌注导致的肾损伤程度。
[0035]
进一步的，将近红外分子探针azabdp-dioh溶于乙腈或dmso的水溶液，配制得到探针溶液，用于同时检测活细胞中clo-和gsh；优选的，所述乙腈或dmso的水溶液浓度为10μm，ph＝7.2，所述乙腈或dmso的水溶液中，乙腈或dmso与水的体积比为9:1。
[0036]
进一步的，所述应用的检测仪器为紫外检测仪器或光声成像仪器；
[0037]
当检测仪器为紫外检测仪器时，将探针溶液与待测活细胞混合，获得待测体系，待测活细胞clo-浓度增加，待测体系在682nm的紫外吸收减弱，在965nm处增强；待测活细胞gsh浓度增加，待测体系在682nm的紫外吸收增强，在965nm处减弱，从而定性检测待测活细胞中clo-、gsh的含量变化趋势；通过965nm处紫外信号值与682nm处紫外信号的比值，即(abs
965
/abs
682
)，从而定量分析待测活细胞clo-和/或gsh的含量；
[0038]
当检测仪器为光声成像仪器时，将探针溶液与待测活细胞混合，获得待测体系，待测活细胞clo-浓度增加，待测体系在680nm的光声信号减弱，在970nm处增强；待测活细胞gsh浓度增加，待测体系在在680nm的光声信号增强，在970nm处减弱，从而定性检测待测活细胞中clo-、gsh的含量变化趋势；通过970nm处光声信号值与680nm处光声信号的比值，即(pa
970
/pa
680
)，从而定量分析待测活细胞clo-和/或gsh的含量；进而通过970nm处光声信号值/680nm处光声信号值的比值评价肾缺血再灌注导致的损伤程度，比值越大，表明肾缺血再灌注导致的肾损伤越严重。
[0039]
进一步的，前述的近红外分子探针azabdp-dioh在制备肾缺血再灌注损伤程度检测试剂和/或试剂盒和/或光声成像造影剂中的应用。
[0040]
本发明的有益效果在于：
[0041]
提供了一种以bodipy(氮杂氟硼二吡咯)为母核的新修饰结构的近红外分子探针；本发明所述的近红外分子探针对clo-/gsh氧化还原可逆响应特异性强、灵敏度高；本发明所述的近红外分子探针分子制备流程简单、产率高，适合规模化生产；本发明所述的近红外分子探针作为光声成像造影剂来评价肾缺血再灌注模型中肾脏的损伤程度，光声成像效果良好，可以实时、无创地采用光声成像系统监测待评价肾缺血再灌注的肾脏损伤情况，该评价方法操作简便，易于推广，在生物成像方面具有广阔的应用前景。
附图说明
[0042]
图1为本发明得到的化合物1的核磁氢谱图；
[0043]
图2为本发明得到的化合物1的核磁碳谱图；
[0044]
图3为本发明得到的化合物2的核磁氢谱图；
[0045]
图4为本发明得到的化合物2的核磁碳谱图；
[0046]
图5为本发明得到的azabdp-dioh的核磁氢谱图；
[0047]
图6为本发明得到的azabdp-dioh的核磁碳谱图；
[0048]
图7为本发明得到的azabdp-dioh的hr-esi质谱图；
[0049]
图8为本发明得到的azabdp-dio的hr-esi质谱图；
[0050]
图9为本发明得到的azabdp-dioh随clo-浓度变化而变化的紫外光谱图；
[0051]
图10为本发明得到的azabdp-dioh随clo-浓度变化而变化的abs
965
/abs
682
的线性变化；
[0052]
图11为本发明得到的azabdp-dioh对clo-的离子选择性；
[0053]
图12为本发明得到的azabdp-dio随gsh浓度变化而变化的紫外光谱图；
[0054]
图13为本发明得到的azabdp-dio对gsh的离子选择性；
[0055]
图14为本发明得到的azabdp-dioh生物相容性图；
[0056]
图15为本发明得到的azabdp-dioh光声仿体图；
[0057]
图16为本发明得到的azabdp-dioh在空白和iri组小鼠肾脏区域的光声成像以及光声信号值图。
具体实施方式
[0058]
本发明所述clo-是指次氯酸根；
[0059]
本发明所述gsh是指谷胱甘肽；
[0060]
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不应视为对本发明范围的限制。
[0061]
实施例1化合物1的制备：
[0062]
将3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛(0.02mol)和4-甲氧基苯乙酮(0.02mol)溶于20ml乙醇中后加入3g氢氧化钾(0.05mol)，所得混合物在室温下搅拌1h，过滤沉淀产物，用20ml乙醇洗涤并减压干燥，得到浅黄色固体化合物1(565mg，产率33％)。
[0063]
实施例1制备的化合物1核磁氢谱和碳谱如图1、2所示，图1为氢谱结果。1h nmr(400mhz，cdcl3，25℃，tms)，δ＝8.07-8.01(m，2h)，7.79(d，j＝15.6hz，1h)，7.58-7.51(m，2h)，7.49(s，1h)，7.23(d，j＝8.0hz，2h)，7.01-6.96(m，2h)，3.89(s，3h)，2.39(s，3h)ppm；图2为碳谱结果，
13
c nmr(101mhz，cdcl3，25℃，tms)，δ＝188.8，163.4，144.1，140.8，132.3，131.2，130.8，129.7，128.4，120.9，113.8，55.5，21.5ppm。
[0064]
实施例2化合物2的制备：
[0065]
将化合物1(20mmol)、硝基甲烷(10ml)和二乙胺(10ml)溶于甲醇(30ml)加热回流10h。在室温下冷却后，在真空中去除溶剂并用水清洗。有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩，得到黄色油液化合物2(565mg，产率33％)。
[0066]
实施例2制备的化合物2核磁氢谱和碳谱如图3、4所示，图3为氢谱结果。1h nmr(400mhz，cdcl3，25℃，tms)，δ＝7.94-7.87(m，2h)，7.15(q，j＝8.2hz，4h)，6.94-6.89(m，2h)，5.29(s，1h)，4.82(dd，j＝12.4，6.5hz，1h)，4.65(dd，j＝12.4，8.2hz，1h)，4.22-4.13(m，1h)，3.86(s，3h)，3.40-3.33(m，1h)，2.31(s，3h)ppm；图4为碳谱结果，
13
c nmr(101mhz，cdcl3，25℃，tms)，δ＝195.5，163.8，137.4，136.4，130.4，129.6，127.0，113.9，79.8，55.5，53.6，41.2，39.2，21.4ppm。
[0067]
实施例3近红外分子探针azabdp-dioh的合成：
[0068]
将化合物2(1.0mmol)和醋酸铵(20mmol)溶于乙醇(20ml)中回流9h，冷却至室温并浓缩至约5ml。用乙醇洗涤和过滤沉淀物，以获得蓝黑色固体产物氮杂二吡咯烯，该产物可直接使用，无需纯化。向甲苯(100ml)中加入得到的氮杂二吡咯烷(0.23mmol，100ml)，添加三乙胺(4ml)和三氟化硼二乙醚(6ml)。将混合物在60℃下搅拌2h。冷却至室温后，在真空下去除溶剂。残渣用乙醇洗涤和过滤，得到红色固体，即为近红外光声探针azabdp-dioh(产率83％)。
[0069]
实施例3制备的探针的核磁氢谱、核磁碳谱、质谱如图5、6、7所示。1h nmr(400mhz，cdcl3，25℃，tms)，δ＝8.07-8.04(m，4h，phenyl)，7.59(s，4h，phenyl)，7.02-7.98(m，4h，phenyl)，6.80(s，2h，pyrrolyl)，5.42(s，2h，-oh)，3.88(s，6h，-och3)，1.37(s，36h，-c(ch3)3)ppm；
13
c nmr(100mhz，cdcl3，25℃)，δ＝161.9，155.2，153.0，141.3，137.2，136.3，133.4，131.4，130.6，128.3，124.6，117.5，116.8，116.3，116.1，34.3，30.3，14.8ppm；ms
(hr-esi)：calcd for c
50h58
bf2n3o4[m

]：813.4488，found：813.4491。
[0070]
实施例4近红外分子探针azabdp-dioh对溶液中clo-浓度改变的响应：
[0071]
将探针azabdp-dioh溶于ch3cn水溶液(10μm，ph＝7.2，ch3cn：h2o＝9:1(v/v))中，配制成azabdp-dioh浓度为10μm的溶液，然后，依次加入溶于ch3cn水溶液的2-20μm不同浓度的clo-溶液，具体的，clo-溶液中clo-的浓度分别为：2.8μm、4.0μm、7.5μm、10μm，20μm用质谱表征azabdp-dioh被clo-氧化后的产物azabdp-dio，如图8所示。同时用紫外分光光度计测试不同clo-浓度条件下的紫外光谱，如图9所示。结果表明，azabdp-dio在682nm左右的紫外吸收强度明显减弱，在965nm左右的紫外吸收强度明显增强，说明该探针可以对clo-进行检测，且abs
965
/abs
682
线性增加，进而对clo-进行定量分析(如图10)。
[0072]
实施例5近红外分子探针azabdp-dioh对clo-的选择性
[0073]
将探针azabdp-dioh和clo-、h2o2、roo-、cu
2
、
·o2-、onoo-、fe
3
、hg
2
等不同活性氧、金属离子、阴离子分别溶于ch3cn水溶液(10mm，ph＝7.2，ch3cn：h2o＝9:1(v/v))中，配制成浓度为10μm的探针溶液和浓度为100μm的不同离子溶液。利用紫外分光光度计测试在探针溶液中加入不同离子溶液之后的紫外光谱变化，如图11所示，只有在clo-离子存在下，溶液最大吸收在965nm处，其他干扰离子存在下，溶液最大吸收均在682nm处，该结果表明本发明所述的探针对clo-具有良好的选择性。
[0074]
实施例6近红外分子探针azabdp-dio对溶液中gsh浓度改变的响应
[0075]
将探针azabdp-dioh溶于ch3cn水溶液(10μm，ph＝7.2，ch3cn：h2o＝9:1(v/v))中，配制成azabdp-dioh浓度为10μm的溶液，加入15μm的clo-水溶液，配制得到azabdp-dioh和clo-混合溶液，向azabdp-dioh和clo-混合溶液中滴定加入15-80μm不同浓度的gsh溶液，具体的，gsh溶液中gsh的浓度分别为：15μm，20μm，25μm，30μm、35μm，40μm、45μm，50μm、55μm，60μm，65μm，70μm，75μm，80μm,用紫外分光光度计测试不同gsh浓度条件下对体系紫外吸收影响，如图12所示。结果表明，溶液在682nm左右的紫外吸收强度明显增强，在965nm左右的紫外吸收强度明显减弱，说明azabdp-dio被gsh特异性还原成azabdp-dioh，该探针可以对clo-/gsh氧化还原过程进行检测。
[0076]
实施例7 azabdp-dio对gsh的选择性
[0077]
将gsh、na

、cu

、fe
2
、cys、no
2-等不同还原剂分别溶于ch3cn水溶液(10mm，ph＝7.2，ch3cn：h2o＝9:1(v/v))中，配制成浓度为100μm的不同还原剂溶液。然后，在实施例6所述的azabdp-dioh和clo-混合溶液中，依次加入不同还原剂溶液，利用紫外分光光度计对不同混合溶液进行波长全扫描，记录波长扫描结果，如图13所示。结果表明，在gsh存在下，azabdp-dio才能被还原成azabdp-dioh，溶液最大紫外吸收由985nm蓝移到682nm，说明azabdp-dio对gsh具有良好的选择性。
[0078]
实施例8 azabdp-dioh的生物相容性分析
[0079]
将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw 264.7和小鼠肝细胞aml-12细胞在含10％fbs的dmem中培养(37℃、5％co2)。首先将细胞以8000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养12h，然后将近红外分子探针azabdp-dioh溶于ch3cn水溶液(10mm，ph＝7.2，ch3cn：h2o＝9:1(v/v))，配制得到不同浓度(0、10、20、40、60、80、100μm)的azabdp-dioh探针溶液，用不同浓度的探针溶液处理细胞。之后，细胞在37℃和5％co2下再孵育24h。每孔加入200μl mtt(0.5mg/ml)溶液，37℃孵育4h，制得蓝紫色结晶甲瓒。去除上清，用200μl dmso裂解产物。最
后，在570nm(测量波长)和650nm(参比波长)处用酶标仪测定吸光度。接着，选用雄性icr小鼠分别注射生理盐水(1μmol/kg)和azabdp-dioh(1μmol/kg)24h后，分别对小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠主要脏器进行h&e染色。实验结果如图14所示。azabdp-dioh与两种细胞共培养24h，细胞存活率均大于85％，且注射azabdp-dioh 24h后小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠组织形态正常，证明azabdp-dioh具有良好的生物相容性。
[0080]
实施例9 azabdp-dioh进行仿体试验
[0081]
azabdp-dioh在不同clo-浓度(0μm、1μm、2μm、5μm，28μm，30μm，40μm，60μm，90μm)的ch3cn水溶液中，用四氟毛细管吸取不同clo-浓度的溶液，置于光声成像仪平台上，以680-970nm波长激光激发，采集光声图像，并记录光声信号值。结果如图15所示，图15a、b、c可以看出随着clo-浓度增加，680nm光声信号明显减弱，而970nm光声信号明显增强，且在clo-浓度为0-90μm范围内680nm和970nm的光声信号比(pa
970
/pa
680
)和clo-呈良好的线性关系。在图15d中，clo-诱导的pa
970
增加在添加gsh后可以恢复到原始值，这证明了azabdp-dioh是一种可靠的氧化还原光声指示剂。
[0082]
实施例10肾缺血再灌注模型的构建
[0083]
选用雄性icr小鼠，将小鼠随机分为空白、iri-12h、iri-24h、iri-48h组。iri组(iri：肾缺血再灌注)小鼠进行肾缺血再灌注手术，具体方法如下：小鼠使用异氟烷麻醉后，使用无损伤微型动脉夹迅速阻断左肾蒂，肾脏由红色变紫黑色表示缺血成功，持续夹闭45min后松开动脉夹，肾脏恢复灌注后关闭腹腔，建立iri模型；空白组小鼠打开腹腔并找到肾蒂，但不夹闭肾蒂，手术期间使用恒温台保持小鼠体温，手术完成后缝合腹腔。
[0084]
实施例11
[0085]
将azabdp-dioh探针溶于ch3cn水溶液配制得到探针溶液(azabdp-dioh浓度为80-100μm)，将实施例10中的四组小鼠麻醉后，经尾静脉将探针溶液注入小鼠体内后，通过visualsonic vevo 2100lazer系统在手术后的不同时间点(0、24h、48h、72h)对小鼠进行成像，激发波长为680nm和970nm。检测结果如图16所示，随着手术时间的加长，左肾光声信号强度增加(图16a)，且通过光声信号pa
970
/pa
680
比值，表明肾缺血再灌注导致的肾损伤越来越严重(图16b)，同时，也进一步证明了azabdp-dioh具有良好的光声成像效果，可以作为光声成像造影剂来评价肾缺血再灌注肾损伤。
[0086]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，这些改进和变换应属于本发明所附权利要求的保护范围。