本发明涉及dna检测，具体地，涉及一种胞外dna提取方法的评估体系及其应用，尤其地，用于土壤微生物的胞外dna提取方法的评估。
背景技术：
1、土壤微生物长期以来被称为“暗物质”(杨云峰，微生物学通报，2020，47(9))，高通量测序技术的迅速发展成为打开土壤黑箱的钥匙，也促进了土壤微生物生态学，特别是群落结构、功能及其环境响应研究的蓬勃发展(朱永官等，中国科学院院刊，2017，32(6))，越来越多的研究开始考虑到胞外dna对微生物群落结构的影响。然而，虽然已经形成了多种胞外dna提取方法，它们流程不同，繁简各异(ogram et al.，journal of microbiologicalmethods，1987，7(2-3))，但是迄今并没有一个被广泛接受的通用方法。此外，不同提取方法之间结果差异较大，难以相互比较，这些因素既阻碍了对胞外dna的深入认识，也妨碍了对大量土壤微生物群落学研究结果的准确判读和综合归纳。
2、胞外dna提取分离方法的关键参数包括缓冲液的种类和用量、振荡的强度和时间、离心的转速和时间、纯化柱和洗脱液的种类和用量，面临的核心问题是胞外dna的回收率、完整性与胞内dna的裂解释放之间的矛盾。首先，从回收率来看，胞外dna的分离一般是缓冲液洗脱，结合离心将洗脱的胞外dna上清液和包含胞内dna的沉淀进行分离，如果缓冲液过少，土壤颗粒与缓冲液的作用不充分，胞外dna的洗脱效率就会大大降低；如果振荡和离心等强度过大、时间过长，就可能造成细胞破裂和胞内dna释放，导致高估胞外dna的数量(nagler et al.，applied microbiology and biotechnology,2018，102)；其次从提取方法对dna片段的完整性影响来看，在分离纯化过程中，胞外dna容易接触到土壤中的dna酶(dnase)，导致dna降解(blum et al.，systematic and applied microbiology,1997，20(4))；除此之外，涡旋、混匀和离心过程中的剪切力也会在一定程度上影响所得dna的完整性，进而影响胞外dna水平转移的可能性，以及解析出的活性微生物群落结构的真实性。最后，从提取方法对细胞的破碎程度来分析，在对胞外dna进行提取与分离时的各种操作可能会使活体微生物细胞破碎，释放出胞内dna，从而导致胞外dna的数量被高估，组成发生变化。因此在评估提取方法时，不仅要考虑提取方法对胞外dna的提取效率，也要考虑其对细胞完整性的影响程度。
3、进一步地，胞外dna提取中包含有不同长度的dna片段，在提取的dna定量检测中对于短片段dna暂没有较好的定量方法，也导致现有的提取方法的定量存在一定的误差，并不能反应提取的dna的真实水平。
4、针对上述存在的技术问题，本发明依据ascher等(applied soil ecology，2009，42(2))提出的顺序提取法、ctab法(2005)和酶处理法(2018)进行提取胞外dna，建立了一套适用于现有技术已有的胞外dna提取方法的、具有极强通用性的评估体系，能够针对现有技术已有的提取方法进行回收率、dna片段的完整性和细胞的破碎程度的评价，且能够对不同长度的dna片段尤其是小于100bp的dna片段进行定量检测从而真实反映胞外dna提取的效率和提取方法对细胞和/dna片段的影响，并能够将不同提取方法得到的提取结果进行比较，为活性微生物群落的结构的真实性提供指导依据。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的技术问题，本发明提供一种胞外dna提取方法的评估体系，在现有技术中已有的胞外dna提取方法的基础上对检测结果进行评估，且能够对不同长度的dna片段进行定量检测能够真实反映提取方法的提取效率，以及能够对细胞提取中dna片段的完整性和细胞的破碎程度进行分析，全面、准确地评价提取方法，为活性微生物群落结构的真实性提供依据。
2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，一种胞外dna提取方法的评估体系，在土壤样品中加入dna标准品，采用不同的提取方法进行提取dna标准品，并以提取的胞外dna的回收率、dna完整性以及活体细胞破碎程度进行定量检测，通过所述定量检测的结果来评估不同的胞外dna提取方法对土壤微生物的胞外dna的提取效果，同时可验证该评估体系的可行性。
3、优选地，所述胞外dna提取方法包括但不限于顺序提取法、ctab法和酶处理法。
4、优选地，所述dna标准品包括胞内dna标准品和胞外dna标准品；所述胞外dna标准品包括短片段dna标准品、长片段dna标准品以及介于两者之间的标准片段dna标准品，其中，所述短片段dna的长度为≤100bp，所述长片段dna为5000～6000bp。
5、优选地，分别将所述胞内dna标准品、所述短片段dna、所述长片段dna和标准片段dna标准品加入土壤样品中，利用胞外dna提取方法对胞外dna进行提取，并分别进行胞外dna的回收率、dna完整性以及活体细胞破碎程度的定量检测，并将提取结果进行比较，评估基于不同提取方法对所述胞外dna提取的结果，进而实现对土壤微生物的胞外dna的提取做出评估。
6、优选地，所述dna标准品的制备方法包括将人工改造质粒导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选含有人工改造质粒的大肠杆菌，即获得胞内dna标准品；所述人工改造质粒在自然土壤环境中不存在。
7、优选地，所述标准片段dna标准品的制备方法包括采用酶切后将肌动蛋白基因插入topo载体中，构建载体；再将构建好的所述载体导入大肠杆菌感受态细胞中，并对转化后的大肠杆菌进行筛选，并提取质粒；将获得的所述质粒用肌动蛋白引物扩增后酶切，经回收和纯化后进行pcr扩增，直至得到足够的所述标准片段dna标准品。
8、优选地，所述短片段dna标准品通过寡核苷酸合成技术合成两条互补的小于100bp长度的单链，根据碱基互补配对原则，两条互补单链将结合为短片段双链，将其作为短片段dna标准品。
9、优选地，所述长片段dna标准品通过将质粒经酶切开环后获得长片段dna。
10、优选地，所述长片段dna标准品选择哺乳动物高拷贝载体pcdna3.1+构建长片段dna。
11、优选地，所述人工改造质粒为含细胞周期蛋白依赖性抑制酶基因p21。
12、优选地，所述短片段标准品制备方法包括设计两条互补短片段单链a1和a2，然后将这两条短片段混匀后，95℃加热10min，在室温下自然冷却；使用sybr染料检测，基于凝胶电泳的位置，以及染料与双链dna结合后在紫外光下呈绿色的现象，判断短片段双链a的形成。
13、优选地，所述短片段标准品的定量检测方法包括构建比短片段dna单链a1或短片段dna单链a2数量多一倍的长片段dna单链b，所述长片段单链b含有与dna单链a2互补序列的dna单链b2，与dna单链b2两端的序列配对的短链分别是dna单链c和dna单链d；其中dna单链c与dna单链b中的b1互补，dna单链d与dna单链b中的dna单链b3互补；向体系中加入与dna单链b等量的dna单链c和dna单链d；将所有的dna单链混合后在95℃下加热10min，自然冷却；根据碱基互补配对原则，可获得长度为70bp的双链dna；利用探针法，加入正向引物进行qpcr定量，进行qpcr定量。
14、优选地，所述dna单链a1的序列包括aaatggacaggacacatgctatgacct。
15、所述dna单链a2的序列包括aggtcatagcatgtgtcctgtccattt。
16、所述dna长单链b中的序列包括gatgacccatctaatgctgacgaaatggacagg acacatgctatgacctcattggctcgacaccgaacat。
17、所述dna单链c包括ctactgggtagattacgacagc。
18、所述dna单链d包括gtaaccgagctgtggcttgta。
19、所述特异性引物(包括正向引物)序列包括gatgacccatctaatgctga。
20、所述探针的序列包括5’fam tggacaggacacatgctatgac3’mgb。
21、利用上述步骤对土壤微生物的胞外dna提取进行评估，分别对不同的提取方法进行评估后，能够得到所提取的土壤微生物的胞外dna的真实水平，进而能够对所检测的土壤微生物群落的研究提供指导作用和数据支撑，从而能够解析出土壤活性微生物群落结构的真实性。
22、同时将上述的评估体系应用于其它领域的胞外dna提取中，能够通过建立统一的评估体系对采用不同提取方法进行评估后从而得到最接近真实的微生物群落分布情况。
23、本发明技术方案的技术效果：
24、1.通过采用本发明的技术方案，提供了一种胞外dna提取方法的评估体系，能够对不同的提取方法建立统一的评价方法，通过该评估体系能够对不同的提取方法得到的结果进行判断和归纳，从而为胞外dna提取的进一步研究提供评价标准，促进土壤微生物群落学研究结果的准确判读和综合归纳。
25、2.采用本发明技术方案，通过向土壤中添加dna标准品，采用不同的提取方法进行提取dna的标准品，并检测不同方法提取的dna回收率、dna完整性以及活体细胞破碎程度等三项指标，评估不同提取方法对胞外dna的提取效果来验证该评估体系的可行性，其评估方法全面、准确，且操作方法简单。
26、3.本发明提供的评估体系具有普适性，不仅可以用于土壤微生物细胞的胞外dna的提取方法的评估，也可用其它细胞的胞外dna的提取方法的评估，能够针对顺序提取法、ctab法和酶处理法等进行的胞外dna提取的方法进行综合评估，提高对胞外dna研究的进一步深入了解以及判断的准确。
27、4.通过本发明提供的评估体系，能够将现有技术中无法进行直接比较的胞外dna提取方法进行综合对比，通过评估后的结果得到最接近实际情况的菌落分布，能够广泛地应用于包括土壤微生物菌落分布的其它领域中，为活性微生物菌落的分布的解析具有指导意义。
28、5.采用本发明技术方案还能够提供一种为短片段dna的定量检测方法，尤其是能够针对40bp以下的短片段dna实现精准定量，从而能够修正采用现有提取方法对该dna检测的误差。
1.一种胞外dna提取方法的评估体系，在土壤样品中加入dna标准品，采用不同的提取方法进行提取dna标准品，并以提取的胞外dna的回收率、dna完整性以及活体细胞破碎程度进行定量检测，通过所述定量检测的结果来评估不同的胞外dna提取方法对土壤微生物的胞外dna的提取效果，同时可验证该评估体系的可行性。
2.根据权利要求1所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，所述胞外dna提取方法包括顺序提取法、ctab法和酶处理法；
3.根据权利要求2所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，分别将所述胞内dna标准品、所述短片段dna、所述长片段dna和标准片段dna标准品加入土壤样品中，利用胞外dna提取方法对胞外dna进行提取，并分别进行胞外dna的回收率、dna完整性以及活体细胞破碎程度的定量检测，并将提取结果进行比较，评估基于不同提取方法对所述胞外dna提取的结果，进而实现对土壤微生物胞外dna的提取做出评估。
4.根据权利要求1-3任一项所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，所述胞内dna标准品的制备方法包括将人工改造质粒导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选含有人工改造质粒的大肠杆菌，即获得胞内dna标准品；所述人工改造质粒在自然土壤环境中不存在；
5.根据权利要求4所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的胞外dna提取方法的评估体系，其特征在于，
9.如权利要求1-8任一项所述的胞外dna提取方法的评估体系在土壤微生物的胞外dna提取中的应用。
10.如权利要求1-8任一项所述的胞外dna提取方法的评估体系在胞外dna提取中的应用。
