本发明涉及化学修饰电极制备方法及其生物传感应用，尤其是涉及一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3分析检测中的应用研究，属于纳米生物材料和化学生物传感。
背景技术：
1、金属有机框架(mofs)因其结构优美和性质独特受到科学家的广泛关注。mofs是一类新兴的多孔结晶材料，一般以阳离子过渡金属、碱土金属等作为节点，与羧酸盐、膦酸盐、偶氮化物等有机配体通过配位键形成各种不同孔道尺寸和形状的周期网络结构，通常被广泛用于催化、气体存储、分离、化学传感等领域。随着时代的发展，无毒绿色友好的mof材料已经受到各行各业的青睐，例如药物传送、分析传感等。生物金属有机框架(biomof)是将生物基元(如核碱基、氨基酸、卟啉等)引入传统或是纯化学mof当中，延伸了mof框架类型并形成无限周期性网络结构，不仅具有mof材料本身良好的性质，还增加了一些新的特性，如对环境污染小、可重复利用、吸附性能佳等，兼具科学意义和应用前景。
2、caspases是最具代表性凋亡酶之一，是一个半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞调亡或者说细胞程序性死亡、坏死和炎症中发挥重要作用。如果细胞凋亡发生故障，则会引发肿瘤生长和身免疫件疾病；另外如果发生异常的细胞凋亡则会导致缺血或老年痴呆症的发生，对于该疾病的研究是通过刺激半胱氨酸蛋白酶作为治疗把点以期待治愈胆碱能神经元作为一种重要的功能神经元广泛存在于中枢神经系统中，具有不同形态特征和行使着多种功能，如参与人类运动、学习和记忆等生理活动，同时又是临床上多种中枢神经系统退行性疾病的靶细胞。总之，无论是在动物体的正常还是异常生理状态(癌症)下，对于整个机体都是绝对重要的。caspases的基因突变或者缺失都是致命的。因此，有效的caspases检测对疾病的发生发展探索及预后治疗十分重要。
3、本发明专利选用细胞凋亡中caspase-3作为主要研究对象，创建了一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法。首先，通过简单的水热合成方法，合成一种新型的柱形磁性bio-mof，该材料带有较多负性基团和多孔结构，能够较好地吸附在磁性玻碳电极表面，也能够较好地吸附样本溶液中的带正电荷的亚甲基蓝分子(mb)；其次，合成了一种“太阳花”式的磁性纳米粒子，该粒子以cofeo4@au为核心，通过au-s键合作用将含有devd特异性序列和mb分子的多肽修饰于表面，呈现类太阳花的状态。当存在大量的caspase-3时，能够特异性地剪切多肽，多肽断裂后mb游离于溶液中，能够被柱形磁性bio-mof修饰电极捕获，并于-0.22v处呈现mb的电化学峰。但是当无caspase-3存在时，该处无电化学信号峰。基于此，本专利以ac-devd-cho为抑制剂模板，实现了抑制剂的筛选；以jurkat细胞为模型，实现了实际样本中caspase-3的分析检测，用来评估细胞凋亡，这种简单高效的电化学方法为今后进一步研究急性t细胞白血病提供了基础理论和检验方法。目前为止，尚未发现柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3分析监测中应用的案例，具有较好的科学意义和社会效益。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用。
2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，具体步骤如下：
3、(1)柱形磁性bio-mof修饰电极的制备
4、a.柱形磁性bio-mof的合成：将七水合硫酸锌(0.01～0.05mmol)、硝酸铁(0.01～0.05mmol)、腺嘌呤(0.01～0.05mmol)、均苯四甲酸(0.01～0.05mmol)和4，4’-联苯二甲酸(0.01～0.025mmol)在1～4ml二甲基亚砜(dmf)和0.1～1ml二次蒸馏水中的混合并将其密封在2～10ml的玻璃管中，在20～80℃的烘箱中恒温加热12～72h，然后以1～5℃/h的速度冷却至环境温度，得到无色晶体，用dmf洗涤并用磁铁收集，随后分散至含0.01％～0.05％nafion的二次蒸馏水，控制浓度为0.1～0.5mg/ml，备用。
5、b.电极制备：取2～10μl上述柱形bio-mof滴于打磨好的磁性玻碳电极表面，于室温下孵育1～2h，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，备用。
6、(2)caspase分析传感方法的构建
7、a、cofeo4@au材料的合成。
8、首先，将0.1～1g fe(no3)3和0.3～0.4g co(no3)2·h2o超声溶解到10～100ml二次蒸馏水中，然后缓缓加入10～50ml 0.5～1g/ml的nabh4水溶液，室温下磁力搅拌0.2～1h，转移至高压釜中50～200℃加热0.3～1h，用磁铁收集并交替用水、乙醇洗涤1次，超声分散于二次蒸馏水中，同时加入1～2ml 10～25wt％nh3·h2o和0.2～1ml 50～98wt％aptms在室温下继续搅拌2～12h，用磁铁收集并交替用水、乙醇洗涤1次，于20～50℃下干燥2～12h，重新分散于二次蒸馏水中，控制浓度为0.3～1mg/ml，得到cofeo4粒子，备用。
9、其次，将0.3～1mlhaucl4溶液(2～13.5mm，0.1～1wt％水溶液)快速加入到搅拌的溶液中。溶液逐渐从无色变为黄色，最后变为黑褐色，表明形成了2nm金晶种，在室温下继续搅拌0.3～2h。然后，将得到的金溶液和上述cofeo4粒子以1:3混合搅拌5～12h，用磁铁收集并交替用水、乙醇洗涤1次，于30～50℃下干燥10～12h，重新分散于二次蒸馏水中，控制浓度为0.2～1mg/ml，得到cofeo4@au溶液，备用。
10、b.多肽溶液制备，准备一条商业化修饰多肽：亚甲基蓝-甘氨酰-天冬氨酰-谷氨酰-缬氨酰-天冬氨酰-半胱氨酰-半胱氨酰-精氨酰-半胱氨酰(mb-gdevdccrc)，将其分散溶解于0.1m醋酸缓冲溶液(ph 5.2，hac-naac，含10mm tcep)，控制多肽最终浓度为0.1～0.2mm。
11、c.peptide#cofeo4@au的合成：取b中100～500μl多肽加入100～500μl a中cofeo4@au溶液，孵育1～2h，用磁铁收集并用二次蒸馏水洗涤1次，得到peptide#cofeo4@au，再重新至0.3～1ml二次蒸馏水中，备用。
12、d.caspase反应体系：总体积100μl——取10～30μl上述peptide#cofeo4@au溶液，20～50μl 10～25mm hepes(ph 7.4，含10mm nacl)，5～10μl 200～1000ng/ml caspase-3和5～10μl二次蒸馏水混合均匀，于25～37℃孵育10～30min。随后用磁铁分离，用微型针头导出上清液，用于后续的电化学实验。
13、e.取5～10μl上清液滴于步骤(1)制备的柱形磁性bio-mof修饰电极表面，10～30min后，通过方波极谱技术(swv)进行检测，参数设置为：起始电压，-0.5v；最终电压，0.1v；振幅，0.025v；频率，15hz。
14、f.抑制剂实验：步骤d中，在caspase-3酶反应前，先将caspase-3与5～10μl 50～100μmac-devd-cho孵育5～10min，其余程序同步骤d。
15、基于以上步骤(1)-(2)，在程序(2)-d，改变caspase-3的浓度(终浓度：0～300ng/ml)，其它步骤不变，可实现不同浓度caspase-3的活性分析。
16、基于以上步骤(1)-(2)，在程序(2)-f，改变ac-devd-cho的浓度(终浓度：0～200μm)，其它步骤不变，可实现不同浓度ac-devd-cho的分析检测。
17、利用上述一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，利用电化学方波极谱法(swv)，设置电位范围为-0.5v到0.1v，振幅为0.025v；频率为15hz。利用swv技术对mb分子的电化学响应，通过caspase-3来控制mb的释放，实现caspase-3的电化学分析检测，通过改变caspase-3浓度获得一系列不同浓度caspase-3对应的swv电流强度大小，建立swv电流强度与caspase-3浓度之间的线性关系，根据两者之间的线性关系，确定实际细胞凋亡样本中caspase-3浓度。
18、发明原理：本发明是一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用。首先，通过一种简单水热合成法合成了特殊的柱形磁性bio-mof，具有负电荷、多孔、磁性等特性，能够较好地吸附在磁性玻碳电极表面，也能较好地与mb分子结合；当caspase-3存在时，由于剪切效应peptide#cofeo4@au释放了大量mb分子，被柱形磁性bio-mof修饰电极吸附后，在-0.22v处有较好的电化学响应，反之，则没有电化学响应。本专利利用上述所提分析检测原理，不仅实现了不同浓度的caspase-3分析检测，还进行了抑制剂的筛选，并且为实际细胞凋亡样本中caspase-3的高灵敏检测提供了一种新的思路。
19、现有技术相比，本发明的优点在于：本发明是一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，显然，在一定浓度范围内，caspase-3浓度越大，释放的mb分子越多，swv电化学响应越大。实验结果表明，电流强度的大小与caspase-3浓度在一定范围内呈现线性关系，成功实现对caspase-3的分析检测。其优点在于：
20、(1)新型磁性材料。a、通过绿色合成方法合成了一种柱形磁性bio-mof，该材料带有负电荷，能够吸附带有正电荷的分子；该材料具有很多孔洞结构，方便其他的内容物进入促进吸附作用；该材料用腺嘌呤组成，具有较好的生物相容性；b、合成了一种类太阳花状的磁性材料peptide#cofeo4@au，该材料具有较好的磁性，方便分离富集；该材料具有较好的分散性，带来较大的负载量。
21、(2)新颖的方法。本专利第一次构建了一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法，并将其用于细胞凋亡过程中caspase-3分析检测，该方法酶反应在均相溶液中进行，反应效率高；电极修饰过程十分快速简单，一步修饰减少了误差和假阳性信号，具有较好的准确性。
22、(3)高灵敏度。本发明基于一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法，得到一条线性方程：电流响应对caspase-3浓度线性相关方程为y＝0.03589x+0.1354，r2＝0.9925，线性范围为0.01～100ng/ml，检测的最低浓度为0.01ng/ml，说明该传感器可对caspase-3实现高灵敏度检测；对抑制剂分子ac-devd-cho，ic50为7.98μm。
23、(4)高特异性。本专利是利用caspase-3对特异性多肽序列“devd”的识别，具有较强的特异性，能够对caspase-3实现选择性检测。
24、(5)结果准确。回收率均在96％～103.7％之间。
25、(6)制备与检测方法试剂用量少、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对caspase-3的高灵敏检测，且为细胞凋亡进程中caspase-3检测提供新思路。
26、综上所述，本发明是一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度caspase-3的检测，具有良好的应用前景。
1.一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，其特征在于，实验机理如下：首先，通过一种简单水热合成法合成了特殊的柱形磁性bio-mof，具有负电荷、多孔、磁性等特性，能够较好地吸附在磁性玻碳电极表面，也能较好地与mb分子结合；当caspase-3存在时，由于剪切效应peptide#cofeo4@au释放了大量mb分子，被柱形磁性bio-mof修饰电极吸附后，在-0.22v处有较好的电化学响应，反之，则没有电化学响应。本专利利用上述所提分析检测原理，不仅实现了不同浓度的caspase-3分析检测，还进行了抑制剂的筛选，并且为实际细胞凋亡样本中caspase-3的高灵敏检测提供了一种新的思路。
2.根据权利要求1-2所述一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，其特征在于：通过绿色合成方法合成了一种柱形磁性bio-mof，该材料带有负电荷，能够吸附带有正电荷的分子；该材料具有很多孔洞结构，方便其他的内容物进入促进吸附作用；该材料用腺嘌呤组成，具有较好的生物相容性；合成了一种类太阳花状的磁性材料peptide#cofeo4@au，该材料具有较好的磁性，方便分离富集；该材料具有较好的分散性，带来较大的负载量。
3.根据权利要求1-3所述一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，其特征在于：本专利第一次构建了一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法，该方法利用磁性分离与富集原则实现了mb分子的控制释放，通过mb分子的swv电流响应信号作为输出实现细胞凋亡过程中caspase-3分析检测，该方法酶反应在均相溶液中进行，反应效率高；电极修饰过程十分快速简单，一步修饰减少了误差和假阳性信号，具有较好的准确性。
4.根据权利要求1-3所述一种柱形磁性bio-mof修饰电极制备方法及其在caspase-3检测中的应用，其特征在于：该方法对caspase-3具有较高的灵敏度和优秀的选择性。电流响应对caspase-3浓度线性相关方程为y＝0.03589x+0.1354，r2＝0.9925，线性范围为0.01～100ng/ml，检测的最低浓度为0.01ng/ml，说明该传感器可对caspase-3实现高灵敏度检测；对抑制剂分子ac-devd-cho，ic50为7.98μm。
