本发明属于石油污染土壤生物修复，特别涉及一种石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法。
背景技术：
1、全球气候变化制约人类社会发展，如何转化、利用与封存大气中二氧化碳已成为当今社会关注的焦点。有部分研究者提出了土壤微生物碳泵(microbial carbon pump，mcp)概念，强调土壤微生同化合成作用对土壤碳库积累有积极作用，微生物残体碳作为土壤稳定有机碳库的重要组分，对土壤碳截获与有机碳固存具有重要作用。
2、固碳微生物是一类具有固碳功能的微生物，该类微生物主要通过同化作用实现光合co2固定。土壤固碳微生物大多为蓝细菌、光合细菌、微藻等光能自养型微生物及铁细菌、硫细菌、氢细菌等化能自养型微生物。目前，国内外针对固碳微生物的研究，主要集中在海洋、稻田、农田、湿地等生境的碳储量分布与评估、微生物固碳过程与固碳机理、微藻固碳与生物能源技术等方面，而针对石油烃等难降解有机物胁迫下的土壤生境中是否存在降污固碳微生物类群及其互作响应关系的研究尚属空白。
3、现有技术中，中国专利申请cn202210862210.6公开了一种提升化能自养细菌固碳效率的方法，该方法在包括反应器主体、其中放置的膜组件及曝气装置中实现，通过膜组件将增值富集的大量化能自养细菌截留在反应器内，实现高效固碳活性，但该方法仅关注较为单纯的化能自养微生物，并未同步考察具备降解石油烃功能微生物的协同作用，此方法并不适用。此外，中国专利cn202211370039.3公开了一种提高公园林地率低碳汇能力和碳减排的复合微生物强化菌剂，该菌剂由多种光合细菌、乳酸菌、假单胞菌、放线菌、谷草芽孢杆菌和酵母菌组成，可稳定发挥菌剂提高植株生长能力与光合作用，具备改善土壤结构与土壤肥力、抑制虫害与病原菌多种功效。但该发明同样仅考虑微生物的固碳功能，且仅适用于公园绿地等未污染土壤生境，无法表征石油污染胁迫下的土壤生境中降污协同固碳微生物的真实状况。
4、因此，仍需要提供一种针对石油污染胁迫下土壤生境的，降污固碳协同微生物考察新方法。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明的主要目的在于提供一种石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，以解决现有技术中石油烃等难降解有机物胁迫下的土壤生境中降污固碳微生物类群及其互作响应关系的研究尚属空白的问题。
2、具体的技术方案如下：一种石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，包括：
3、采集并测定石油污染土壤样品中的总石油烃含量；
4、对所述土壤样品进行微生物多样性测序，根据微生物多样性测序结果并结合spearman相关性分析确定土壤样品中的潜在降污固碳功能微生物关键属；
5、利用qpcr测定所述土壤样品中典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的丰度，并根据丰度测定结果及spearman相关性分析确定所述典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因之间的相关性；
6、选取典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因丰度最高的若干个土壤样品进行宏基因组测序，注释所述典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的组成及代谢通路；
7、根据潜在降污固碳微生物中典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的代谢通路预测污染土壤样品中降污固碳微生物群落结构与代谢通路的互作关系。
8、进一步地，所述石油污染土壤包括石油污染表层土壤、含油污泥和/或含油固废残渣。
9、进一步地，对所述土壤样品进行微生物多样性测序包括以下步骤：
10、提取所述土壤样品中的微生物群落总dna；
11、以10ng微生物群落总dna为模板dna，加入4μl 5×fastpfu buffer，2μl 2.5mmdntps，0.8μl的引物338f和0.8μl的引物806r，0.4μl fastpfu polymerase，0.2μlbsa溶液，加无菌ddh2o至20μl，得到第一预备液；
12、对所述第一预备液进行扩增反应，扩增反应的程序为95℃预变性3min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，29个循环，72℃最终延伸10min；
13、对扩增成功后的产物进行微生物多样性测序。
14、进一步地，确定土壤样品中的潜在降污固碳功能微生物关键属具体包括以下步骤：
15、以alpha多样性指数作为评价土壤微生物群落多样性和丰富度的综合性指标；
16、在97％的相似水平上进行otu序列分类，选择土壤样品中相对丰度最高的若干个门水平优势物种；
17、采用spearman相关性分析对可能同时具备石油烃降解及固碳功能的门水平物种中总丰度前若干名的属水平物种进行筛选，保留若干个门水平优势物种；
18、对筛选后的门水平优势物种中的属水平物种进行网络节点属性分析，根据连通性及度中心性确定土壤样品中的潜在降污固碳功能微生物关键属。
19、进一步地，利用qpcr测定所述土壤样品中典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的丰度包括以下步骤：
20、提取所述土壤样品中典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因dna；
21、设计典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的引物序列；
22、利用qpcr对所述典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因dna进行扩增；
23、对扩增成功后的dna进行丰度测定。
24、进一步地，利用qpcr对所述典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因进行dna扩增具体为：
25、以典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因dna为模板dna，加入7.5μl 2×sybrgreen mix、0.7μl的正向引物和0.7μl反向引物，加无菌ddh2o至15μl，得到第二预备液；
26、对所述第二预备液进行扩增反应，扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸35s，45个循环。
27、进一步地，典型石油烃降解功能基因包括alkb、pah-rhdαgn和pah-rhdαgp；
28、典型固碳功能基因包括cbbl、cbbm、aclb和fhs。
29、进一步地，选取典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因丰度最高的若干个土壤样品进行宏基因组测序具体包括以下步骤：
30、提取石油烃降解功能基因和固碳功能基因丰度最高的若干个土壤样品的微生物群落dna；
31、将所述微生物群落dna片段化，筛选约300-500bp片段构建宏基因组文库；
32、建立宏基因组文库后进行桥式pcr扩增，得到dna片段序列；
33、对所述dna片段进行宏基因组测序。
34、进一步地，注释所述典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的组成及代谢通路包括以下步骤：
35、利用kegg数据库注释所述典型石油烃降解功能基因和固碳功能基因的组成及代谢通路；
36、根据注释结果预测土壤样品中是否存在潜在降污固碳微生物。
37、进一步地，所述代谢通路包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢和机体系统。
38、本发明的有益效果：
39、本发明通过采集石油污染表层土壤或含油污泥样品，再分析石油烃降解功能基因及固碳功能基因丰度以及各土壤样品中的微生物群落多样性及降污固碳代谢通路，并根据结果分析微生物群落结构与代谢通路的互作关系。上述方法可以实现从微生物群落结构变化、功能基因丰度、微生物代谢通路等多角度分析及考察石油污染胁迫下土壤降污固碳微生物状况。
40、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
1.一种石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
5.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
8.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
9.根据权利要求1所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
10.根据权利要求9所述的石油污染胁迫下土壤降污固碳协同微生物的考察方法，其特征在于，
