本发明涉及一种筛选具有区域选择性的小分子靶标的核酸适配的方法，属于生物。
背景技术：
1、核酸适配体的筛选技术，即富集配体进化技术(systematic evolution ofligandsby exponential enrichment，selex)(nature，1990，346(6287)，818-822；science，1990，249(4968)，505-510.)是一种以体外合成文库、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)以及测序等技术为基础建立的核酸适配体体外筛选技术。selex技术的基本原理是将寡聚核苷酸(dna或者rna)文库与特定的靶标分子进行孵育，通过分离技术将与靶标分子结合的寡聚核苷酸分离出来，通过pcr技术进行指数扩增，将得到的产物进行单链制备得到次级文库，将次级文库作为下一轮的起始文库重新开始新一轮的筛选。通过多轮的筛选过程，最终获得具有高亲和力、高特异性的核酸适配体。
2、selex技术自提出以来，在多个领域得到了广泛的应用。然而利用传统的selex技术筛选获得高特异性的小分子靶标的核酸适配体，依然非常困难。实际样品中常常含有多种小分子结构类似物，而且有些结构类似物的浓度比靶标的浓度还要高很多倍，因此这些结构类似物与靶标的核酸适配体存在强的交叉反应，导致对靶标含量测定的不准确性，甚至无法实现定量检测。目前特异性能够满足临床检测需求的核酸适配体数量很少。
3、另外，传统的selex技术操作繁琐，筛选周期较长。为了加快核酸适配体的筛选过程，近些年来发展了多种改进的selex技术，缩短了筛选周期。这些改进技术selex过程中的分离步骤进行改进，将传统的基于亲和柱或者醋酸纤维素膜的分离技术用更为高效或者便捷的分离方式替代。这些改进的方法包括：磁珠分离(nucleic acids research 2003，31(18)，e110-e118)、毛细管电泳技术(analytical chemistry 2004，76(18)，5387-5392)、凝胶电泳技术(nucleic acids research 2005，33(17)，e141-e147)、微流控芯片法(proc.natl.acad.sci.u.s.a.2009，106，2989-2994)、表面等离子体共振技术(analyticalbiochemistry 2005，342(2)，312-317)。但是这些方法多数仅适用于加快对蛋白质靶标核酸适配体的筛选，筛选小分子靶标的核酸适配体依然效率低，迫切需要新的快速筛选技术。
4、在目前的各种筛选小分子靶标核酸适配体筛选技术当中，最常用的有三种方法。(1)基于靶标固定的方法。该方法中小分子靶标被固定在磁珠或者琼脂糖球上，将磁珠或者琼脂糖球与文库孵育，然后分离磁珠或者琼脂糖球，将吸附在磁珠或者琼脂糖球上的核酸序列进行洗脱，从而实现文库富集。这种方法中固相基质存在严重的非特异性吸附，另外靶标在固相表面固定还会掩蔽靶标的结合位点，影响靶标的构象，因而文库的富集效率通常很低，甚至失败，通常需要10-20轮才能获得具有纳摩尔每升到微摩尔每升解离常数的核酸适配体。(2)基于文库固定的方法。该方法将随即文库通过互补的捕获链组装到磁珠或者琼脂糖球上，将磁珠或者琼脂糖球与靶标孵育，然后分离磁珠或者琼脂糖球，收集上清液，从而实现文库富集。该方法近些年来在小分子靶标核酸适配体筛选中应用广泛，但存在文库自解离严重，富集效率低的问题。(3)均相核酸适配体的筛选方法。该方法不需要将靶标分子或者文库固定到固相介质上，而是将文库直接与靶标分子在溶液中孵育，随后利用氧化石墨烯等纳米材料对单链未结合序列和与靶标结合的部分折叠序列的吸附力的差异(chemical communications 2014，50(72)，10513-10516)，分离富集文库。由于筛选过程中靶标分子处于自由的游离状态，与实际样品中所处的状态相同，因而通过均相筛选技术获得的核酸适配体理论上更加适合于后期的应用。尽管均相核酸适配体的筛选方法克服了基于固定靶标或者固定文库的核酸适配体筛选方法的问题，但仍有一定的缺陷。氧化石墨烯分离的分离效率受靶标的物理性质影响很大，难于控制。
5、小分子结构类似物在分子结构上包含共有结构域和专有结构域两部分。理论上能够与专有结构域和共有结构域同时结合，且对专有结合域具有更高亲和力的核酸适配体将具有更高的特异性，对其结构类似物具有更低的交叉反应。然而，按照上述筛选小分子靶标核酸适配体的方法所获得的核酸适配体与靶标的结合位置、对共有结构域和专有结构域的亲和力均是不确定的。为了获得高特异性的小分子靶标的核酸适配体，急需开发具有区域选择性核酸适配体的快速筛选新方法。
6、具有区域选择性的有机反应推动了合成和药物化学的革命性发展。经典的区域或者位置选择性有机反应通过采用共价保护基团来实现。近些年来，非共价作用也正发展成为一类控制有机反应区域或者位置选择性的新方法。rna核酸适配体被用来保护小分子，使得多个具有类似反应活性的官能团中，只有1个未与适配体结合或者屏蔽的官能团能够发生化学反应(aptamer protective groups tolerate different reagents andreactions for regioselective modification of neomycin b.org.biomol.chem.2020，18(47)，9606-9610；selective transformations of complex molecules are enabledby aptameric protective groups.nat.chem.2012，4(10)，789-793；probing theshielding properties of aptameric protective groups.chem.asian j.2014，9(8)，2225-2231)。受到上述核酸适配体与靶标结合，抑制靶标上被结合或者被掩蔽区域官能团发生有机反应的现象，本发明提供一种筛选具有区域选择性的小分子靶标的核酸适配的方法。
技术实现思路
1、本发明目的是提供一种筛选具有区域选择性的小分子靶标的核酸适配的方法。该方法基于核酸-靶标结合抑制靶标上被结合或者被掩蔽区域官能团发生有机反应的现象，包括如下步骤：步骤1、文库热处理；步骤2、活化磁珠或琼脂糖球；步骤3、磁珠或琼脂糖球负筛选；步骤4、文库与靶标孵育；步骤5、通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列；步骤6、磁珠或琼脂糖球上结合核酸的洗脱；步骤7、pcr；步骤8、单链dna制备。
2、上述方法中，步骤4和步骤5利用如下原理：以氨基酸核酸适配体的筛选为例，筛选结合到氨基酸专有结构域侧链r的核酸适配体，氨基酸含有α氨基(胺基-nh2)、羧基和侧链r，核酸适配体与氨基酸分子的多个结构域结合，有些序列与胺基和r均结合；有些序列与胺基结合强结合，但是不与r结合或者与r弱结合；有些序列与r强结合，但是不与胺基结合或者弱结合，在这些核酸适配体中，与r强结合，但是不与胺基结合或者弱结合的序列预期具有最好的特异性，与适配体结合力强的胺基或者被所结合序列掩蔽的胺基，不能与磁珠或者琼脂糖上活化的羧基发生交联反应，因此不被磁珠或者琼脂糖球富集；而与适配体不结合或者弱结合的胺基能够与磁珠或者琼脂糖上活化的羧基发生交联反应，因此被磁珠或者琼脂糖球捕获和富集，这样就实现了对侧链r具有高亲和力的核酸适配体，根据靶标分子结构的不同，所选用的功能化的磁珠或琼脂糖的种类不同，部分类型的功能化的磁珠或琼脂糖无需步骤2的活化处理。
3、其中将上述步骤1-8循环2-5轮以实现对文库的快速富集。
4、在上述方法中，
5、步骤1、文库热处理如下：取适量文库于缓冲溶液中进行热处理：95℃水浴加热，冰浴猝冷，放置室温；
6、步骤2、根据靶标分子结构的不同，所选用的功能化的磁珠或琼脂糖的种类不同，部分类型的功能化的磁珠或琼脂糖无需步骤2的活化处理。当靶标分子的共有结构域具有一级胺基时，可以采用羧基功能化的磁珠或者琼脂糖球。活化磁珠或者琼脂糖球如下：将羧基修饰的磁珠或者琼脂糖球用n-羟基丁二酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，生成nhs活性酯修饰的磁珠或者琼脂糖球；
7、步骤3、磁珠或者琼脂糖球负筛选如下：取部分步骤2制备的nhs活化磁珠与步骤1中的文库孵育，磁性或重力分离，上清用于步骤4；
8、步骤4、文库与靶标孵育如下：在筛选缓冲液中将步骤3所收集的文库与靶标按照一定摩尔比混合、孵育；为了减小体系中游离小分子(未与核酸适配体结合)的数量，该步骤中文库大量过剩。注意在使用传统selex筛选小分子靶标核酸适配体时，小分子靶标相比文库是大量过量的，通常在微摩尔每升，甚至毫摩尔每升浓度范围。本发明中文库过量，小分子靶标的浓度低至纳摩尔每升范围。
9、步骤5、通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列如下：步骤2制备的nhs活化磁珠与步骤4中的文库和靶标混合液孵育、磁性或者重力分离，清洗磁珠；
10、步骤6、磁珠或者琼脂糖球上结合核酸的洗脱如下：将一定量蛋白酶k与步骤5得到的磁珠或者琼脂糖球孵育，或者将步骤5得到的磁珠或者琼脂糖球加缓冲溶液加热，孵育，收集上清液；
11、步骤7、pcr如下：将步骤6所得到的洗脱液进行pcr，乙醇沉淀法纯化pcr产物；
12、步骤8、单链dna制备如下：单链dna的制备可以采用生物素-链霉亲和素法、长短链凝胶电泳法、λ噬菌体核酸外切酶法等各种方法。其中λ噬菌体核酸外切酶法包括λ噬菌体核酸外切酶降解pcr产物中5’磷酸根修饰的反义链、乙醇沉淀法纯化酶切产物，紫外定量每轮产物，所获得的单链dna文库为次级文库，该次级文库进入下一轮的筛选或进行克隆测序。
13、在上述中还包括以下步骤：
14、(1)选取代表性富集序列进行化学合成；
15、(2)对化学合成的序列进行亲和力、选择性和功能性测试。
16、为了进一步提高核酸适配体的靶标特异性，还可以在文库富集3-5轮后，进行潜在干扰物或者结构类似物的负筛选，包括以下步骤：
17、(1)对与靶标分子结构差异较大的潜在干扰物进行负筛选时，在上述步骤4之前，添加对潜在干扰物的负筛步骤。具体操作为，将潜在干扰物包被的磁珠或者琼脂糖球与文库孵育，取上清用于步骤4。
18、(2)对与靶标分子的结构类似物进行负筛选时，在上述步骤4之前，添加对结构类似物的负筛步骤。具体操作为，将文库与结构类似物孵育，加入能够与结构类似物专有结构域发生交联反应的磁珠或者琼脂糖球，取上清用于步骤4。
19、本发明的方法具有如下优势：
20、1、本发明方法可以筛选出具有区域选择性的小分子靶标的核酸适配体，核酸适配体对专有结构域具有高亲和力，对共有结合域的亲和力相对较弱，因此核酸适配体对靶标具有高特异性，对靶标的结构类似物具有低交叉反应；
21、2、本发明方法利用反应条件温和的正交有机反应，反应效率高，与水溶液体系兼容性好，因此文库的富集效率高；
22、3、本发明方法中靶标和文库在均相体系进行孵育，结合过程不受固相界面的干扰，克服了现有筛选技术中靶标固定住固相上的缺陷，避免了表面固定掩蔽靶标结合位点和影响靶标构象的问题，也同时大幅减小了固相介质对文库的非特异性吸附，非常有利于加快核酸适配体的筛选效率；
23、4、本发明方法通过磁性分离技术或者琼脂糖重力分离将与靶标结合的核酸序列分离出来，无需昂贵或者特殊的设备，操作简单快捷，无需任何条件优化。
1.一种筛选具有区域选择性的小分子靶标的核酸适配体的方法，其特征在于，该方法基于核酸-靶标结合抑制靶标上被结合或者被掩蔽区域官能团发生有机反应的现象，包括如下步骤：步骤1、文库热处理；步骤2、活化磁珠或琼脂糖球；步骤3、磁珠或琼脂糖球负筛选；步骤4、文库与靶标孵育；步骤5、通过交联反应捕获与靶标结合的核酸序列；步骤6、磁珠或琼脂糖球上结合核酸的洗脱；步骤7、pcr；步骤8、单链dna制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4和步骤5利用如下原理：以氨基酸核酸适配体的筛选为例，筛选结合到氨基酸专有结构域侧链r的核酸适配体，氨基酸含有α氨基(胺基-nh2)、羧基和侧链r，核酸适配体与氨基酸分子的多个结构域结合，有些序列与胺基和r均结合；有些序列与胺基结合强结合，但是不与r结合或者与r弱结合；有些序列与r强结合，但是不与胺基结合或者弱结合，在这些核酸适配体中，与r强结合，但是不与胺基结合或者弱结合的序列预期具有最好的特异性，与适配体结合力强的胺基或者被所结合序列掩蔽的胺基，不能与磁珠或者琼脂糖上活化的羧基发生交联反应，因此不被磁珠或者琼脂糖球富集；而与适配体不结合或者弱结合的胺基能够与磁珠或者琼脂糖上活化的羧基发生交联反应，因此被磁珠或者琼脂糖球捕获和富集，这样就实现了对侧链r具有高亲和力的核酸适配体，根据靶标分子结构的不同，所选用的功能化的磁珠或琼脂糖的种类不同，部分类型的功能化的磁珠或琼脂糖无需步骤2的活化处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将上述步骤1-8循环2-5轮以实现对文库的快速富集，
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，为了进一步提高核酸适配体的靶标特异性，还可以在文库富集3-5轮后，进行潜在干扰物或者结构类似物的负筛选，包括以下步骤：
