本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、心血管疾病严重危害人类健康，心肌缺血/再灌注(mypcardial ischemia/reperfusion，i/r)治疗是目前急性心梗最常用的治疗方式，通过介入的方式快速疏通血管可以及时将新鲜的血液输送到心肌缺血区域，有效缓解缺血、缺氧造成的心肌损伤，然而再灌注本身又会造成缺血心肌不可逆转的严重损伤，导致心肌梗死，目前尚无有效的解决方案。研究显示，干细胞、非编码rna、功能性蛋白质及多种化学药物都具有出色的心肌保护作用和临床转化潜力，但也面临着巨大的挑战。心脏是在高速血流剪切力环境中，持续搏动的特殊器官。因此，心肌保护因子或药物无论通过心肌内注射、静脉注射或口服后，能够到达并驻留在心肌细胞的有效浓度过低，治疗效果受限。传统的运送载体，如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、脂质体等都无法避免靶向效率低，载体毒性，失靶现象，低效基因运送，被肝/肾/脾等快速清除，体内生物半衰期短以及引起炎症和免疫反应等诸多缺陷，严重影响基因治疗的安全性和有效性。
2、外泌体作为细胞自体分泌的囊泡状小体，具有良好的生物学分布和生物相容性，天然，稳定，纳米尺寸，可穿透生物屏障，不引起免疫反应，还可以携带单一或随意组合的治疗制剂，具有基因运送载体的优良特征。但是，天然未经修饰的外泌体不具有组织选择性，这些未经修饰的外泌体无论通过肌肉注射、静脉注射或口服的方式进入体内后，都无法避免机体的首过效应，会优先在肝、肾、脾等器官富集并被代谢清除，能够到达并驻留在心肌组织的很少。这严重限制了干细胞外泌体心肌保护作用的发挥，这也是严重制约干细胞外泌体用于心血管疾病临床治疗的瓶颈问题。因此，为了提高干细胞外泌体的靶向性，中国专利公开号为cn113278591a的专利中，公开了一种心脏靶向性基因工程外泌体及其制备方法和应用，其通过将归巢肽融合表达在外泌体跨膜蛋白的胞外结构域来实现心脏归巢肽crppr展示在外泌体表面，从而实现了crppr的心脏靶向效果和外泌体安全高效的载体特征相融合，为开发更加安全高效的心脏靶向运送载体及心脏靶向药物提供了新的思路。然而，该基因工程外泌体虽然能大大延长外泌体在体内的半衰期，提高所携带基因的心脏运送效果和治疗效果，但因其仅能以心脏整体作为靶向目标，而不能以心脏上的缺血心肌病灶区域作为靶向目标，导致该外泌体的靶向性依然有进一步提高的可能。
3、同时，多项研究证实，mirna-21可以抑制炎症反应，促进血管新生，抑制心肌细胞凋亡，在心梗后的心肌修复，糖尿病足血管重建等多种病理过程发挥关键作用，在心肌缺血的治疗中具有重要应用价值。然而，如何将mirna-21载入外泌体，并通过有效的靶向运送载体运送至心肌缺血区，从而更好的实现心梗后的心肌修复效果，成为mirna-21在心肌缺血治疗中被大规模应用的关键和难点。
技术实现思路
1、本发明的目的在于：针对现有技术存在的外泌体心脏靶向性不佳，抑制心肌细胞凋亡、缩小心梗范围和改善心功能效果较差的问题，提供了一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体(mir21-imhp-exo)及其制备方法和应用。该外泌体不仅在跨膜蛋白lamp2b胞外结构域上高效展示有缺血心肌归巢肽cstsmlkac(ischemia myocardial homing peptide，imhp)，更在其内部高效装载有mirna-21，从而使该外泌体实现了imhp的心脏靶向效果与mirna-21的心肌修复效果及外泌体的心肌保护作用的完美协同，在显著提升了外泌体心脏靶向性(在缺氧/复氧损伤的心肌细胞富集效果显著增强)的同时，还显著提高了外泌体抑制心肌细胞凋亡、缩小心梗范围、改善心功能和改善心室扩张的效果，对缺血性心肌病的治疗提供了一种更为有效的技术手段，并具有广泛的应用前景。
2、为了实现上述目的，本发明提供了一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体，所述外泌体是由过表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna的细胞分泌形成；所述外泌体表面展示缺血心肌归巢肽imhp，且内部装载有mirna-21。
3、本发明一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体，是由过表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna的细胞直接分泌得到的，从而使外泌体表面的imhp展示效率和外泌体中mirna-21的装载量得到显著提高，从而实现了外泌体在缺氧/复氧损伤的心肌细胞富集和治疗效果显著增强；本发明中外泌体的缺血心肌靶向效果和mirna-21的心肌修复作用协同配合，从而使外泌体抑制心肌炎性因子gp130、il-6、tlr-4表达，激活p-ampk/pgc-1α/nrf-2通路，增强细胞抗氧化及抗凋亡蛋白ho-1、sod1、bcl-2表达的效果显著增强；抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡的效果显著提高；缩小心梗范围、抑制心室扩张和改善心功能的效果显著增加。
4、其中，优选的，所述外泌体表面跨膜蛋白lamp2b的胞外结构域展示有缺血心肌归巢肽，且内部装载有mirna-21。
5、其中，优选的，所述imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna是将缺血心肌归巢肽imhp的编码基因克隆到lamp2b信号肽(第35位天冬氨酸)与成熟蛋白(36位丝氨酸)编码基因之间，同时将imhp-lamp2b融合基因和mirna-21的前体基因(pre-mirna-21)通过u6启动子连接而得到的；该克隆dna上同时含有缺血心肌靶向肽展示基因(imhp-lamp2b)和mirna-21的前体基因(pre-mirna-21)，且imhp-lamp2b 5’端连接有cmv启动子，pre-mirna-215’端连接有u6启动子，从而能使imhp-lamp2b和pre-mirna-21在宿主细胞中同时且稳定的过表达，进而在直接分泌得到外泌体时，能使imhp在外泌体表面的展示效率显著提高和mirna-21在外泌体内部的装载量显著增大(具体实施方式中mir21-imhp-exo外泌体中mirna-21的装载量比对照外泌体升高了约50倍)，使imhp与mirna-21达到完美协同，进而使外泌体的各项性能得到显著提高。
6、其中，优选的，所述imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna的基因序列为seq id no.1；所述seq id no.1：
7、atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattgttccacgtcaatgttgaaggcttgctcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagtacgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaactatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcaccattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaagaaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgtaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggactgtcgggtagcttatcagactgatgttgactgttgaatctcatggcaacaccagtcgatgggctgtctgaca；上述下划线部分分别为通过基因工程克隆的缺血心肌靶向肽展示基因和mirna-21的前体基因。
8、其中，优选的，所述外泌体是由稳定表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna的w8b2+心肌祖细胞(cardiac progenitor cells，cpc)，即mir21-imhp-cpc细胞分泌形成。
9、优选的，所述稳定表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna的w8b2+cpc细胞的制备方法包括以下步骤：
10、a、plvx-imhp-lamp2b-pre-mirna-21质粒的构建：
11、a1、合成缺血心脏归巢肽imhp的编码基因和u6-promoter-pre-mirna-21基因；
12、a2、将imhp编码基因克隆到lamp2b信号肽与成熟蛋白编码基因之间，获得缺血心肌归巢肽展示基因imhp-lamp2b；将imhp-lamp2b和u6-promoter-pre-mirna-21连接，获得融合基因imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21；
13、a3、将所述融合基因imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21克隆到plvx-ef1-zsgreen-t2a-puro病毒载体上，得到plvx-imhp-lamp2b-pre-mirna-21质粒。
14、b、mir21-imhp-cpc细胞的建立：
15、b1、用plvx-imhp-lamp2b-pre-mirna-21、pmd2、pspax2质粒共转染hek293t细胞，制备mir21-imhp-lamp2慢病毒颗粒；
16、b2、用mir21-imhp-lamp2b慢病毒颗粒感染w8b2+cpc细胞，然后用流式细胞术对感染后的w8b2+cpc细胞进行分选，选择zsgreen荧光蛋白稳定表达的细胞，得到mir21-imhp-cpc细胞。
17、为达到上述发明目的，进一步的，本发明还提供了一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体的制备方法，包括以下步骤：
18、1、制备mir21-imhp-cpc细胞；
19、2、将mir21-imhp-cpc细胞在imdm基础培养基中培养，收集培养液；
20、3、将步骤2收集的培养液进行分离提纯，得到含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体。
21、为达到上述发明目的，更进一步的，本发明还提供了一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体在制备缺血心脏靶向性药物中的应用。
22、其中，优选的，所述外泌体在制备缺血性心肌病靶向性药物中的应用。
23、与现有技术相比，本发明的有益效果：
24、1、本发明外泌体显著提高了缺血心肌归巢肽imhp在跨膜蛋白lamp2b胞外结构域上展示效率，显著提高了外泌体的靶向性。
25、2、本发明外泌体显著提高了mirna-21的装载量，使外泌体抑制心肌细胞凋亡、缩小心梗范围、抑制心室扩张和改善心功能的效果显著提高。
26、3、本发明外泌体由过表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21dna的细胞直接分泌得到的，能使imhp更好的展示在外泌体表面以及mirna-21更多的被装载在外泌体内部，从而使外泌体上的imhp与mirna-21能达到完美协同，进而使外泌体的各项性能得到显著提高。
27、4、本发明外泌体对缺血性心肌疾病的治疗提供了一种更为有效的技术手段，并具有广泛的应用前景。
1. 一种含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体是由过表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21 dna的细胞分泌形成；所述外泌体表面展示缺血心肌归巢肽imhp，且内部装载有mirna-21。
2.根据权利要求1所述的缺血心肌靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体膜蛋白lamp2b的胞外结构域插入了缺血心肌归巢肽imhp，氨基酸序列为cstsmlkac，且内部装载有mirna-21。
3. 根据权利要求1所述的缺血心肌靶向外泌体，其特征在于，所述imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21 dna是将缺血心肌归巢肽imhp的编码基因克隆到lamp2b信号肽与成熟蛋白编码基因之间，同时将imhp-lamp2b融合基因和mirna-21的前体基因通过u6启动子连接而得到的。
4. 根据权利要求3所述的缺血心肌靶向外泌体，其特征在于，所述imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21 dna的基因序列为seq id no.1。
5. 根据权利要求1所述的缺血心肌靶向外泌体，其特征在于，所述外泌体是通过稳定表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21 dna的w8b2+心肌祖细胞分泌形成。
6. 根据权利要求5所述的缺血心肌靶向外泌体，其特征在于，所述稳定表达imhp-lamp2b-u6-promoter-pre-mirna-21 dna的w8b2+心肌祖细胞制备方法包括以下步骤：
7.一种权利要求1-6任一项所述含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.一种如权利要求1-6任一项所述含有mirna-21的缺血心肌靶向外泌体的应用，其特征在于，在制备心脏靶向性药物中的应用。
9.根据权利要求8所述缺血心肌靶向外泌体的应用，其特征在于，在制备缺血性心脏疾病靶向性药物中的应用。
