本发明涉及通过使用具有eno1基因的启动子的外源基因表达载体而得到的、外源蛋白质的转录活性增强的哺乳动物转化细胞、以及使用其的该外源蛋白质的制造方法。
背景技术：
1、由于基因重组技术的发展，治疗用蛋白质、抗体药物这样的蛋白质性药品的市场正在迅速地扩大。其中，就抗体药物而言，即使对人体施予，引起有害的免疫反应的风险也低，并且其特异性高，因此正在积极地进行开发。
2、作为生产以抗体药物为代表的蛋白质性药物的宿主，可举出微生物、酵母、动植物细胞、昆虫、转基因动植物等。就蛋白质性药物的生理活性、抗原性而言，多数情况下需要正确的折叠、糖链修饰等翻译后修饰，因此不能进行糖链修饰的微生物、糖链结构差异较大的植物不适合作为宿主。具有与人类似的糖链结构、能进行翻译后修饰、而且从大量的使用实际情况考虑在安全性方面没有疑虑的cho(chinese hamster ovary：中国仓鼠的卵巢)细胞等哺乳动物培养细胞成为现在的主流。
3、在以哺乳动物培养细胞为宿主的情况下，与微生物等相比，存在增殖速度低、生产率低、昂贵的成本等问题(非专利文献1)。另外，为了在临床上利用抗体药品，需要大量的施予，因此在世界范围内其生产能力的不足也成为问题。在利用哺乳类培养细胞表达系统制造蛋白质性药品的情况下，与合成低分子药品相比制造成本高，因此通过各制造工序的改良来谋求制造成本的降低，而哺乳类培养细胞表达系统中的生产量的提高也是降低制造成本的有效方法(非专利文献2、3)。因此，为了提高哺乳动物培养细胞中的外源蛋白质的生产率，迄今为止，就启动子、增强子、药剂筛选标记、基因扩增、培养工程方法等多种途径进行了错误的尝试。
4、在使用cho细胞作为宿主细胞的情况下，在外源基因的表达、即蛋白质性药品的生产中，通常使用来源于病毒的人巨细胞病毒极早期启动子(human cytomegalovirus majorimmediate early promoter，以下为cmv启动子)(非专利文献4、5、6)。另外，已知在cho细胞中，可以将作为延伸因子1α(elongation factor-1alpha)的ef1α(专利文献1、非专利文献7)、作为人核糖体蛋白基因的rpl32、rps11的转录起始点的上游区域的多核苷酸(启动子区域)单独或与其它异源启动子组合用于蛋白质表达(非专利文献8，专利文献2、3)。哺乳动物细胞中，提高了外源蛋白质的生产率的热激蛋白a5(hspa5/grp78)基因及热激蛋白a8(hspa8)的启动子是已知的(专利文献4、5)。
5、现有技术文献
6、专利文献
7、专利文献1：日本专利第3051411号
8、专利文献2：国际公报第2006/123097号
9、专利文献3：国际公报第2013/080934号
10、专利文献4：国际公报第2018/066492号
11、专利文献5：国际公报第2020/032153号
12、非专利文献
13、非专利文献1：florian m.wurm.,nat.biotechnol.22(11):1393-1398,2004
14、非专利文献2：farid ss.,j chromatogr b analyt technol biomed lifesci.848(1):8-18,2007
15、非专利文献3：werner rg.economic aspects of commercial manufacture ofbiopharmaceuticals.j biotechnol.113(1-3):171-182,2004
16、非专利文献4:durocher y等人，curr opin biotechnol.20(6):700-707,2009
17、非专利文献5：boshart m等人，cell.41(2):521-530,1985
18、非专利文献6：foecking mk等人，gene.45(1):101-105,1986非专利文献7：deerjr.and allison ds.,biotechnol.prog.20:880-889,2004
19、非专利文献8：hoeksema f.等人，biotechnology research international、volume 2011,article id 492875,11页
技术实现思路
1、发明所要解决的课题
2、本发明的课题在于提供在哺乳动物培养细胞等宿主细胞中具有高的外源基因表达亢进活性的启动子、以及提供使用该启动子使成为蛋白质性药品的外源蛋白质的生产量亢进的手段。
3、用于解决课题的手段
4、为了解决上述课题，本发明提供以下的[1]-[34]。
5、[1]多核苷酸，其是来源于中国仓鼠的基因的启动子，
6、所述多核苷酸选自序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13及序列号14，或者，
7、所述多核苷酸是包含与这些序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
8、[2]如[1]的多核苷酸，其选自序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11及序列号12，或者，
9、所述多核苷酸是包含与这些序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
10、[2a]如[1]或[2]的多核苷酸，其是包含序列号18的核苷酸序列或与该序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列而成的。
11、[3]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号1的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
12、[4]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号3的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
13、[5]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号4的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
14、[6]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号10的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
15、[7]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号11的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
16、[8]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号12的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
17、[9]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号13的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
18、[10]如[1]的多核苷酸，其包含与序列号14的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
19、[10a]多核苷酸，其是来源于中国仓鼠的基因的启动子，所述多核苷酸是包含序列号18的核苷酸序列或与该序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列而成的。
20、[10b]如[10a]的多核苷酸，其选自序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12及序列号13，或者，
21、所述多核苷酸是包含与这些序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
22、[11]多核苷酸，其是来源于小鼠的基因的启动子，
23、所述多核苷酸选自序列号2、序列号17及序列号16，或者，
24、所述多核苷酸是包含与这些序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
25、[11a]如[11]的多核苷酸，其是包含与序列号18的核苷酸序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列而成的。
26、[12]如[11]的多核苷酸，其包含与序列号2的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
27、[13]如[11]的多核苷酸，其包含与序列号17的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
28、[14]如[11]的多核苷酸，其包含与序列号16的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
29、[14a]多核苷酸，其是来源于小鼠的基因的启动子，所述多核苷酸是包含与序列号18的核苷酸序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列而成的。
30、[14b]如[14a]的多核苷酸，其选自序列号2、序列号17及序列号16，或者，
31、所述多核苷酸是包含与这些序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
32、[15]多核苷酸，其具有启动子活性，所述多核苷酸是包含相对于[1]或[11]的序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号2、序列号17或序列号16的核苷酸序列而言具有90％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
33、[16]多核苷酸，其具有启动子活性，所述多核苷酸是包含相对于[1]或[11]的序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号2、序列号17或序列号16的核苷酸序列具有95％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
34、[17]多核苷酸，其具有启动子活性，其是与包含与[1]或[11]的序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号2、序列号17或序列号16的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸。
35、[17a]如[1]-[17]中任一项的多核苷酸，其长度为1kbp以上10kbp以下、2kbp以上6kbp以下、2.6kbp以上5kbp以下、2.7kbp以上4.5kbp以下、2.8kbp以上4kbp以下。
36、[18]多核苷酸，其包含外源基因及[1]-[17]和[17a]中任一项的多核苷酸。
37、[19]外源基因表达单元，其包含外源基因及[1]-[18]和[17a]中任一项的多核苷酸。
38、[19a]如[19]的外源基因表达单元，其还包含转录终止子区域。
39、[20]如[19]或[19a]的外源基因表达单元，其中，外源基因为编码蛋白质的基因。
40、[21]如[20]的外源基因表达单元，其中，外源基因为编码异源多聚体蛋白质的基因。
41、[22]如[21]的外源基因表达单元，其中，外源基因为编码抗体或其抗原结合性片段的基因。
42、[23]外源基因表达载体，其包含[19]-[22]及[19a]中任一项的外源基因表达单元。
43、[24]外源基因表达载体，其包含：
44、[19]-[22]及[19a]中任一项的外源基因表达单元；和
45、选自下述(a)～(e)中任意一者以上的多核苷酸，
46、(a)序列号5的核苷酸序列或其部分序列；
47、(b)序列号6的核苷酸序列或其部分序列；
48、(c)序列号7的核苷酸序列或其部分序列；
49、(d)多核苷酸，其是包含相对于序列号5、序列号6或序列号7的核苷酸序列而言具有80％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的，所述多核苷酸具有外源基因表达亢进活性；
50、(e)多核苷酸，其是包含相对于序列号5、序列号6或序列号7的核苷酸序列而言具有85％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的，所述多核苷酸具有外源基因表达亢进活性。
51、[24a]外源基因表达载体，其包含：
52、[19]-[22]及[19a]中任一项的外源基因表达单元；和
53、下述(b)或(d)的多核苷酸，
54、(b)序列号6的核苷酸序列或其部分序列；
55、(d)多核苷酸，其是包含相对于序列号6的核苷酸序列而言具有80％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的，所述多核苷酸具有外源基因表达亢进活性。
56、[25]转化细胞，其导入了[23]、[24]或[24a]所述的外源基因表达载体。
57、[26]如[24]的转化细胞，其是来源于哺乳动物的培养细胞。
58、[27]如[25]的转化细胞，其是cos-1细胞、293细胞或cho细胞。
59、[28]蛋白质的制造方法，其特征在于，对[25]-[27]中任一项的转化细胞进行培养，从培养物取得来源于外源基因的蛋白质。
60、[29]如[28]所述的制造方法，其中，来源于外源基因的蛋白质为单体蛋白质或多聚体蛋白质。
61、[30]如[29]所述的制造方法，其中，多聚体蛋白质为异源多聚体蛋白质。
62、[31]如[30]所述的制造方法，其中，异源多聚体蛋白质为抗体蛋白质。
63、[31a]如[28]-[31]中任一项的制造方法，其中，转化细胞的培养为补料分批培养(fed-batch culture)。
64、[31b]如[28]-[31]及[31a]中任一项的制造方法，其中，转化细胞被培养6天以上。
65、[32][1]-[18]中任一项的多核苷酸用于在转化细胞中使外源基因表达的用途。
66、[33][23]或[24]的外源基因表达载体的以在转化细胞中使外源基因表达作为目的的用途。
67、[34]通过将[23]、[24]或[24a]的外源基因载体进行基因导入来制造表达外源基因的转化细胞的方法。
68、发明效果
69、根据本发明，提供在哺乳动物培养细胞等宿主细胞中具有高的外源基因表达亢进活性的启动子、以及使用该启动子使成为蛋白质性药品的外源蛋白质的生产量亢进的手段。
1.多核苷酸，其是来源于中国仓鼠的基因的启动子，
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其选自序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11及序列号12，或者，
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号1的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号3的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号4的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号10的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号11的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号12的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
9.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号13的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
10.如权利要求1所述的多核苷酸，其包含与序列号14的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
11.多核苷酸，其是来源于小鼠的基因的启动子，
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其包含与序列号2的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
13.如权利要求11所述的多核苷酸，其包含与序列号17的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
14.如权利要求11所述的多核苷酸，其包含与序列号16的核苷酸序列具有至少99％以上的序列同一性的核苷酸序列。
15.多核苷酸，其具有启动子活性，所述多核苷酸是包含相对于权利要求1或11记载的序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号2、序列号17或序列号16的核苷酸序列而言具有90％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
16.多核苷酸，其具有启动子活性，所述多核苷酸是包含相对于权利要求1或11记载的序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号2、序列号17或序列号16的核苷酸序列而言具有95％以上的序列同一性的核苷酸序列或该核苷酸序列的部分序列而成的。
17.多核苷酸，其具有启动子活性，其是与包含与权利要求1或11记载的序列号1、序列号3、序列号4、序列号10、序列号11、序列号12、序列号13、序列号14、序列号2、序列号17或序列号16的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸。
18.如权利要求17所述的多核苷酸，其是来源于中国仓鼠的基因的启动子，所述多核苷酸是包含序列号18的核苷酸序列或与该序列具有至少85％以上的序列同一性的核苷酸序列而成的。
19.外源基因表达单元，其包含外源基因及权利要求1～18中任一项所述的多核苷酸。
20.如权利要求19所述的外源基因表达单元，其中，外源基因为编码蛋白质的基因。
21.如权利要求20所述的外源基因表达单元，其中，外源基因为编码异源多聚体蛋白质的基因。
22.如权利要求21所述的外源基因表达单元，其中，外源基因为编码抗体或其抗原结合性片段的基因。
23.外源基因表达载体，其包含权利要求19～22中任一项所述的外源基因表达单元。
24.外源基因表达载体，其包含：
25.转化细胞，其导入了权利要求23或24所述的外源基因表达载体。
26.如权利要求25所述的转化细胞，其是来源于哺乳动物的培养细胞。
27.如权利要求26所述的转化细胞，其是cos-1细胞、293细胞或cho细胞。
28.蛋白质的制造方法，其特征在于，对权利要求25～27中任一项所述的转化细胞进行培养，从培养物取得来源于外源基因的蛋白质。
29.如权利要求28所述的制造方法，其中，来源于外源基因的蛋白质为单体蛋白质或多聚体蛋白质。
30.如权利要求29所述的制造方法，其中，多聚体蛋白质为异源多聚体蛋白质。
31.如权利要求30所述的制造方法，其中，异源多聚体蛋白质为抗体蛋白质。
32.权利要求1～18中任一项所述的多核苷酸用于在转化细胞中使外源基因表达的用途。
33.权利要求23或24所述的外源基因表达载体用于在转化细胞中使外源基因表达的用途。
