本技术涉及用于预测在一种基因编辑系统，即引导编辑系统中的脱靶的方法。
背景技术：
1、crispr/cas系统进行的基因组编辑是一个活跃的研究领域。尽管已经对修饰的指导rna等进行了各种研究，并且已经开发了用于基因操纵的cas蛋白，但通过crispr/cas系统进行的基因编辑方法仍然存在问题。由通过crispr/cas系统进行的基因操纵方法产生的许多问题促使人们开发更复杂的基因组编辑技术。这种动机导致了碱基编辑的发展，这是一种更复杂的基因组编辑技术。然而，碱基编辑的应用范围仍然有限。
2、david r.liu等人开发了引导编辑技术，这是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，可用于诱导基因组的插入、缺失、全部12个碱基到碱基的转换及其组合。
3、尽管david r.liu等人开发了一种称为“引导编辑”的基因组编辑新平台，但尚未开发出用于预测在通过引导编辑进行基因组编辑时可能发生的脱靶的方法。由于引导编辑这一基因组编辑新平台的发展，需要开发更适合引导编辑系统的预测脱靶的新方法。
技术实现思路
1、技术问题
2、在基因编辑过程中发生的脱靶会引起强烈的副作用。因此，已经开发了各种预测脱靶的方法。然而，迄今为止已知的方法是针对传统crispr/cas系统开发的，因此应用于新的基因编辑系统，例如引导编辑系统(prime editing system)具有一定的挑战性。因此，本技术公开了一种用于预测引导编辑系统中的脱靶的方法或系统，该方法或系统是针对引导编辑系统开发的。
3、技术方案
4、本技术的一些实施方式提供了一种用于预测在通过引导编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶的方法，包括：
5、(a)获得操纵细胞，
6、其中，操纵细胞包含操纵基因组dna，其中，操纵基因组dna包含标签序列，并且操纵基因组dna通过以下涉及引导编辑蛋白(prime editor protein)和tpegrna的过程生成，包括：
7、(i)将基因组dna与引导编辑蛋白和tpegrna(标签化(tagmentation)pegrna)接触，其中，引导编辑蛋白(prime editor)包含cas蛋白和逆转录酶，其中，tpegrna包含间隔区和含有标签模板的延伸区域，
8、(ii)通过逆转录酶，使用tpegrna的标签模板作为逆转录模板进行的逆转录过程将标签序列插入到基因组dna中；
9、(b)分析操纵基因组dna，以获得关于标签化的信息，
10、其中，关于标签化的信息包括关于插入标签序列的基因组dna区域的信息。
11、在某些实施方式中，预测脱靶的方法还可以包括：
12、基于标签化信息获取脱靶信息，其中，脱靶信息包括是否存在脱靶候选物的信息，以及在存在脱靶候选物的情况下的脱靶候选物区域的信息。
13、在某些实施方式中，预测脱靶的方法还可以包括：
14、验证关于在靶的信息，并将关于在靶的信息与关于标签化的信息进行比较。
15、在某些实施方式中，预测脱靶的方法还可以包括：
16、通过确认在靶信息并将在靶信息与关于标签化的信息进行比较来确认关于是否存在脱靶候选物的信息。
17、在某些实施方式中，标签序列可以插入基因组dna中由tpegrna的间隔区指定的区域中。
18、在某些实施方式中，插入标签序列的区域可以与脱靶候选物区域或在靶标区域相关联(对应)。
19、在某些实施方式中，插入标签序列的区域的信息可以包括关于标签序列所定位的染色体的信息，以及关于标签序列在染色体中存在的区域的信息。
20、在某些实施方式中，脱靶候选物区域的信息可以包括脱靶候选物所定位的染色体的信息，以及脱靶候选物在染色体中存在的区域的信息。
21、在某些实施方式中，标签化信息还可以包括：标签序列与插入标签序列的区域的插入比。
22、在某些实施方式中，脱靶信息还可以包括：脱靶候选物的脱靶预测分数。
23、在某些实施方式中，脱靶信息还可以包括：预测的脱靶候选物数量。
24、在某些实施方式中，可以通过以下方法获得操纵细胞，所述方法包括：将引导编辑蛋白或编码引导编辑蛋白的核酸和tpegrna或编码tpegrna的核酸与细胞接触。
25、在某些实施方式中，操纵细胞可通过如下方法获得，所述方法包括：将引导编辑蛋白或编码引导编辑蛋白的核酸和tpegrna或编码tpegrna的核酸引入细胞中。
26、在某些实施方式中，该方法还可包括：从操纵细胞获得dna，其中，该步骤在(b)之前进行。
27、在某些实施方式中，tpegrna可包括：
28、间隔区；grna核心；以及延伸区域，该延伸区域包括引物结合位点、标签模板和逆转录模板。
29、在某些实施方式中，tpegrna的逆转录模板可包括编辑模板和同源区域。
30、在某些实施方式中，操纵基因组dna可包括编辑。
31、在某些实施方式中，间隔区、grna核心和延伸区域可在5’到3’方向上按间隔区、grna核心和延伸区域的顺序定位。
32、在某些实施方式中，标签模板可位于延伸区域中的引物结合位点和逆转录模板之间。
33、在某些实施方式中，tpegrna还可以包含3’工程区域，该区域包含rna保护基序。
34、在某些实施方式中，预测脱靶的方法还可以包括：
35、验证预定的引导编辑系统，包括以下中的一项或多项：
36、预定的细胞的信息、预定的pegrna的信息、预定的引导编辑蛋白的信息。
37、在某些实施方式中，预定的细胞可以与预测脱靶的方法中使用的细胞不同。
38、在某些实施方式中，tpegrna的间隔区的序列可以与预定的pegrna的间隔区的序列相同，并且tpegrna的引物结合位点的序列可以与预定的pegrna的引物结合位点的序列相同。
39、在某些实施方式中，tpegrna的间隔区的序列可以与预定的pegrna的间隔区的序列相同，tpegrna的引物结合位点的序列可以与预定的pegrna的引物结合位点的序列相同，tpegrna的逆转录模板的序列可以与预定的pegrna的逆转录模板的序列相同。
40、在某些实施方式中，用于预测脱靶的方法中使用的引导编辑蛋白可以与预定的引导编辑蛋白相同或不同。
41、在某些实施方式中，标签模板的长度可以为5nt至60nt。
42、在某些实施方式中，标签模板的长度可以是10nt至50nt。
43、在某些实施方式中，引导编辑蛋白可以是pe-核酸酶，该pe-核酸酶包括具有双链断裂活性的cas蛋白。
44、在某些实施方式中，引导编辑蛋白可以是pemax-核酸酶。
45、在某些实施方式中，引导编辑蛋白中包含的cas蛋白可以是切口酶。
46、在某些实施方式中，引导编辑蛋白可以是pe2引导编辑蛋白。
47、在某些实施方式中，dna基因组的操纵还可以涉及dnmlh1、grna和额外的cas蛋白以及额外的引导编辑蛋白中的一种或多种。
48、在某些实施方式中，其中(b)可以包括：标签特异性地分析操纵基因组dna。
49、在某些实施方式中，(b)可以包括：对操纵基因组dna进行测序。
50、在某些实施方式中，(b)包括：
51、由操纵基因组dna生成标签特异性文库；通过扩增标签特异性文库生成扩增的标签特异性文库；并对扩增的标签特异性文库进行测序。
52、本技术的一些实施方式提供了一种用于预测在通过引导编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶的方法，包括：
53、(a)制备包含一个或多个操纵细胞的细胞群，
54、其中，操纵细胞包含操纵基因组dna，其中，操纵基因组dna包含标签序列，并且操纵基因组dna通过以下涉及引导编辑蛋白和tpegrna的过程生成，包括：
55、(i)将基因组dna与引导编辑蛋白和tpegrna(标签化pegrna)接触，其中，引导编辑蛋白包含cas蛋白和逆转录酶，并且，其中，tpegrna包含间隔区和含有标签模板的延伸区域，
56、(ii)将标签序列插入基因组dna中，其中，标签序列的插入是通过逆转录酶，使用tpegrna的标签模板作为逆转录模板进行的逆转录过程实现的；
57、(b)通过分析由包括对一个或多个操纵细胞的操纵基因组dna进行测序的过程获得的结果，获得标签化信息，
58、其中标签化信息包括每个标签序列插入的一个或多个位点的信息；以及
59、(c)基于标签化信息获得脱靶信息，
60、其中脱靶信息包括是否存在脱靶候选物的信息，以及一个或多个脱靶候选物的区域的信息。
61、本技术的一些实施方式提供了一种标签化pegrna (tpegrna)，其包括：
62、间隔区；grna核心；以及包含标签模板的延伸区域。
63、在某些实施方式中，间隔区、grna核心和包含标签模板的延伸区域可以在5’到3’方向上按照间隔区、grna核心和包含标签模板的延伸区域的顺序定位。
64、在某些实施方式中，延伸区域可以包括标签模板、引物结合位点和逆转录模板。
65、在某些实施方式中，标签模板可以位于延伸区域中的引物结合位点和逆转录模板之间。
66、在某些实施方式中，逆转录模板可以位于标签模板和引物结合位点之间。
67、在某些实施方式中，引物结合位点、标签模板和逆转录模板可以在延伸区域中，在5’到3’方向上按照逆转录模板、标签模板和引物结合位点的顺序定位。
68、在某些实施方式中，逆转录模板可以包括编辑模板和同源区域。
69、在某些实施方式中，标签模板可以具有5nt至60nt的长度。
70、在某些实施方式中，标签模板可以具有10nt至50nt的长度。
71、在某些实施方式中，tpegrna可以进一步包括3’工程区域，其包含rna保护基序。
72、在某些实施方式中，rna保护基序可以具有10nt至60nt的长度。
73、在某些实施方式中，tpegrna可以具有100nt至350nt的长度。
74、本技术的一些实施方式提供了一种用于预测在通过引导编辑系统进行基因组编辑过程中可能发生的脱靶的组合物，包含：
75、tpegrna；以及
76、包括cas蛋白和逆转录酶的引导编辑器。
77、有益效果
78、根据本技术的一些实施方式，一种用于预测引导编辑系统中的脱靶的方法利用引导编辑系统的分子机制，因此与其他已知的脱靶预测方法相比，在预测引导编辑系统中的脱靶方面具有许多优势。
1.一种用于预测在通过引导编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，预测脱靶的方法还包括：
3.根据权利要求1所述的方法，其中，预测脱靶的方法还包括：
4.根据权利要求1所述的方法，其中，预测脱靶的方法还包括：
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标签序列插入到基因组dna中由tpegrna的间隔区指定的区域中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，插入所述标签序列的区域与脱靶候选物区域或在靶标区域相关(对应)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，插入所述标签序列的区域的信息包括所述标签序列所定位的染色体的信息，以及所述标签序列在染色体中存在的区域的信息。
8.根据权利要求2所述的方法，其中，脱靶候选物区域的信息包括脱靶候选物所定位的染色体的信息，以及脱靶候选物在染色体中存在的区域的信息。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标签化信息还包括：
10.根据权利要求2所述的方法，其中，所述脱靶信息还包括：
11.根据权利要求2所述的方法，其中，所述脱靶信息还包括：
12.根据权利要求1所述的方法，其中，通过包括以下的方法获得操纵细胞：
13.根据权利要求1所述的方法，其中，通过包括以下的方法获得操纵细胞：
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述tpegrna包括：
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述tpegrna的逆转录模板包括编辑模板和同源区域。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述操纵基因组dna包括编辑。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，间隔区、grna核心和延伸区域在5’到3’方向上按间隔区、grna核心和延伸区域的顺序定位。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标签模板位于延伸区域中的引物结合位点和逆转录模板之间。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述tpegrna还包括含有rna保护基序的3’工程化区域。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述预定的细胞与用于预测脱靶的方法中使用的细胞不同。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述tpegrna的间隔区的序列与预定的pegrna的间隔区的序列相同，
24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述tpegrna的间隔区的序列与预定的pegrna的间隔区的序列相同，
25.根据权利要求21所述的方法，其中，用于预测脱靶的方法中使用的引导编辑蛋白与预定的引导编辑蛋白相同或不同。
26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标签模板的长度为5nt至60nt。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标签模板的长度为10nt至50nt。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述引导编辑蛋白是包含具有双链断裂活性的cas蛋白的pe-核酸酶。
29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述引导编辑蛋白是pemax-核酸酶。
30.根据权利要求1所述的方法，其中，所述引导编辑蛋白中包含的cas蛋白是切口酶。
31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述引导编辑蛋白是pe2引导编辑蛋白。
32.根据权利要求1所述的方法，其中，dna基因组的操纵还涉及dnmlh1、grna和额外的cas蛋白以及额外的引导编辑蛋白中的一种或多种。
33.根据权利要求1所述的方法，其中，(b)包括：
34.根据权利要求1所述的方法，其中，(b)包括：
35.根据权利要求1所述的方法，其中，(b)包括：
36.一种用于预测在通过引导编辑系统进行基因组编辑过程中发生的脱靶的方法，包括：
37.一种标签化pegrna(tpegrna)，包括：
38.根据权利要求37所述的tpegrna，其中，间隔区、grna核心和包含标签模板的延伸区域在5’到3’方向上按间隔区、grna核心和包含标签模板的延伸区域的顺序定位。
39.根据权利要求37所述的tpegrna，其中，所述延伸区域包含标签模板、引物结合位点和逆转录模板。
40.根据权利要求39所述的tpegrna，其中，所述标签模板位于延伸区域中的引物结合位点和逆转录模板之间。
41.根据权利要求39所述的tpegrna，其中，所述逆转录模板位于标签模板和引物结合位点之间。
42.根据权利要求39所述的tpegrna，其中，引物结合位点、标签模板和逆转录模板在延伸区域中，在5’到3’方向上按逆转录模板、标签模板和引物结合位点的顺序定位。
43.根据权利要求39所述的tpegrna，其中，所述逆转录模板包括编辑模板和同源区域。
44.根据权利要求37所述的tpegrna，其中，所述标签模板的长度为5nt至60nt。
45.根据权利要求37所述的tpegrna，其中，所述标签模板的长度为10nt至50nt。
46.根据权利要求37所述的tpegrna，其中，所述tpegrna还包括含有rna保护基序的3’工程化区域。
47.根据权利要求46所述的tpegrna，其中，所述rna保护基序的长度为10nt至60nt。
48.根据权利要求47所述的tpegrna，其中，所述tpegrna的长度为100nt至350nt。
49.一种用于预测在通过引导编辑系统进行基因组编辑的过程中能够发生的脱靶的组合物，包含：
