本发明涉及生产嵌合绢丝的基因组改造蚕的制作方法和制作试剂盒、以及该基因组改造蚕和由其获得的嵌合绢丝。
背景技术：
1、蓑蛾虫(bagworm)为属于鳞翅目(lepidoptera)蓑蛾科(psychidae)的蛾的幼虫的总称。该蓑蛾虫吐丝的蓑蛾虫绢丝由于与蚕吐丝的绢丝相比具有高物性，因此近年来，作为有用的新的动物性天然纤维而受到关注(专利文献1和非专利文献1)。
2、在将蓑蛾虫绢丝作为纤维原材料而实用化时，存在若干要解决的课题。其一是量产。在从蓑蛾虫获得蓑蛾虫绢丝的情况下，量产中蓑蛾虫的大量饲养技术和从蓑蛾虫有效率地采集绢丝的技术是不可或缺的。然而，蓑蛾虫绢丝产业由于刚刚迎来起步期，因此这些技术大多数处于开发中途阶段，量产化尚需要时间。
3、在蓑蛾虫绢丝的量产中，除了如上述那样从蓑蛾虫直接获得绢丝的方法以外，还有使用基因重组技术等在宿主内生产作为蓑蛾虫绢丝的纤维成分的丝心蛋白蛋白质(在本说明书中，经常表述为“fib蛋白质”)的方法。通过将克隆化了的丝心蛋白基因(在本说明书中，经常表述为“fib基因”)导入到宿主中使其表达，从而能够在宿主细胞内大量生产重组蓑蛾虫fib蛋白质。然而，该技术也具有未充分确定作为蓑蛾虫绢丝的主要成分的丝心蛋白h链蛋白质(在本说明书中，经常表述为“fib h蛋白质”)的全长基因序列这样的问题。这是因为下述理由：由于fib h蛋白质具有甘氨酸残基与丙氨酸残基被大量重复的氨基酸序列，因此通常的克隆化技术极其难以确定碱基序列。此外，在宿主内表达的蓑蛾虫fib蛋白质(在本说明书中，经常表述为“bfib蛋白质”)由于为液态，因此在作为纤维而利用的情况下，必须加工为纤维状。然而，该方法伴有需要时间劳力和制造成本这样的问题。进一步也具有难以将bfib蛋白质通过以往的纺丝技术进行纤维化、需要开发新的纺丝技术这样的问题。
4、另一方面，对于作为用于采集绢丝的家畜昆虫而经5000年以上被饲养的蚕，确立了大量饲养和大量采丝的技术、量产设备。进一步，近年来也能够从使用基因重组技术而制作出的基因重组蚕生产各种基因重组绢丝。
5、因此，本发明者们作为上述蓑蛾虫绢丝的量产化中的问题的早期解决对策，通过构建基于编码蓑蛾虫的fib h蛋白质(在本说明书中，经常表述为“bfib h蛋白质”)的基因的部分碱基序列信息的改造丝心蛋白基因，制作出导入了该改造丝心蛋白基因的基因重组蚕，使其吐丝，从而成功地获得了向蚕绢丝赋予了蓑蛾虫绢丝的物性的嵌合绢丝(专利文献2)。然而，所得的嵌合绢丝的物性虽然具有蓑蛾虫绢丝的一部分特征，但是在获得接近于蓑蛾虫绢丝的物性的绢丝这方面仍留有课题。
6、现有技术文献
7、专利文献
8、专利文献1：日本特开2018-197415
9、专利文献2：wo2018/074403
10、非专利文献
11、非专利文献1：大崎茂芳，2002，繊維学会誌(繊維と工業)，58:74-78
技术实现思路
1、发明所要解决的课题
2、本发明的课题是制作出可以生产蓑蛾虫绢丝的含有率高、由此近似于蓑蛾虫绢丝的物性的与蚕绢丝的嵌合绢丝的蚕，从该蚕以纤维状态获得目标的嵌合绢丝。
3、用于解决课题的手段
4、在专利文献2中通过使用转座子的方法而将目标的基因插入到蚕基因组中而制作出基因重组蚕。然而，通过转座子而被插入的外源性基因的表达效率相对于内源性基因的表达效率停留在数％。本发明者们推定了这是阻碍向上述嵌合绢丝赋予蓑蛾虫绢丝的物性的原因。因此，尝试了代替转座子法而通过使用了tal-pitch法的基因组编辑技术将目标的改造丝心蛋白基因敲入到蚕基因组中。其结果成功地制作出插入了蓑蛾虫改造丝心蛋白基因的基因组改造蚕。所得的基因组改造蚕不仅可以用蚕的绢丝腺生产蚕与蓑蛾虫的嵌合丝心蛋白蛋白质(在本说明书中，经常表述为“嵌合fib蛋白质”)，而且通过使蚕吐丝可以以绢丝的状态获得嵌合fib蛋白质。本发明基于这些开发结果，提供以下方案。
5、(1)改造蚕的制作试剂盒，是生产包含蚕来源的丝心蛋白蛋白质与1种或多种其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质的基因组改造蚕的制作试剂盒，上述制作试剂盒包含left-talen表达载体、right-talen表达载体、和供体载体，上述left-talen表达载体包含left-talen编码区域，上述left-talen编码区域编码left-tale结构域、及其下游的核酸酶结构域，该left-tale结构域识别并结合在蚕丝心蛋白基因中位于上述其它绢丝虫丝心蛋白基因插入位置的5’侧附近的5’侧tale结合区域的碱基序列，上述right-talen表达载体包含right-talen编码区域，上述right-talen编码区域编码right-tale结构域、及其下游的核酸酶结构域，该right-tale结构域识别并结合在蚕丝心蛋白基因中位于上述其它绢丝虫丝心蛋白基因插入位置的3’侧附近的3’侧tale结合区域的碱基序列，上述供体载体包含5’侧tale对应区域、3’侧tale对应区域、5’侧同源区域、3’侧同源区域、和上述其它绢丝虫来源的丝心蛋白基因。
6、(2)根据(1)所述的制作试剂盒，上述供体载体从5’侧起按照5’侧tale对应区域、3’侧同源区域、5’侧同源区域、和3’侧tale对应区域的顺序配置。
7、(3)根据(1)或(2)所述的制作试剂盒，上述其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质为丝心蛋白h链蛋白质。
8、(4)根据(1)～(3)中任一项所述的制作试剂盒，上述其它绢丝虫为蓑蛾虫。
9、(5)根据(4)所述的制作试剂盒，蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质是3个以上相同和/或不同的重复单元连接而成的改造丝心蛋白h链蛋白质，
10、上述重复单元由全长120个～178个氨基酸构成，包含由甘氨酸残基和丙氨酸残基2种氨基酸残基构成的g/a单元30个单元以上，且在其n末端侧包含含有15～25个丙氨酸残基的丙氨酸簇。
11、(6)根据(5)所述的制作试剂盒，上述丙氨酸簇由序列号3或4所示的氨基酸序列构成。
12、(7)根据(5)或(6)所述的制作试剂盒，上述重复单元是选自序列号8～16所示的氨基酸序列中的任意一种以上。
13、(8)根据(4)～(7)中任一项所述的制作试剂盒，编码蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的基因由序列号17～25所示的任一碱基序列构成。
14、(9)基因组改造蚕的制造方法，是在绢丝腺生产包含蚕来源的丝心蛋白蛋白质与1种或多种其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质的基因组改造蚕的制造方法，包括下述工序：将left-talen mrna或left-talen表达载体、right-talen mrna或right-talen表达载体、和供体载体导入到蚕的卵中的核酸导入工序；从上述核酸导入工序后的蚕选择包含其它绢丝虫来源的丝心蛋白基因的转化体的转化体选择工序；以及从上述转化体选择上述其它绢丝虫丝心蛋白基因被插入到蚕基因组的目标位置的个体的基因组插入个体选择工序，上述left-talen mrna包含left-tale区域和编码核酸酶结构域的区域，上述left-tale区域编码left-tale结构域，该left-tale结构域识别并结合在蚕丝心蛋白基因中上述其它绢丝虫丝心蛋白基因插入位置中的5’侧tale结合区域的碱基序列，上述left-talen表达载体包含启动子以及配置在该启动子的表达控制下的上述left-tale区域和编码核酸酶结构域的区域，上述right-talen mrna包含right-tale区域和编码核酸酶结构域的区域，上述right-tale区域编码right-tale结构域，该right-tale结构域识别并结合在蚕丝心蛋白基因中上述其它绢丝虫丝心蛋白基因的插入位置的3’侧tale结合区域的碱基序列，上述right-talen表达载体包含启动子以及配置在该启动子的表达控制下的上述right-tale区域和编码核酸酶结构域的区域，上述供体载体包含5’侧tale对应区域、3’侧tale对应区域、5’侧同源区域、3’侧同源区域、和其它绢丝虫丝心蛋白基因。
15、(10)根据(9)所述的制造方法，上述供体载体以上述其它绢丝虫丝心蛋白基因的正义链方向为基准从5’侧起按照5’侧tale对应区域、3’侧同源区域、5’侧同源区域、和3’侧tale对应区域的顺序配置。
16、(11)根据(9)或(10)所述的制造方法，上述其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质为丝心蛋白h链蛋白质。
17、(12)根据(9)～(11)中任一项所述的制造方法，上述其它绢丝虫为蓑蛾虫。
18、(13)根据(12)所述的制造方法，蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质是3个以上相同和/或不同的重复单元连接而成的改造丝心蛋白h链蛋白质，上述重复单元由全长120个～178个氨基酸构成，包含由甘氨酸残基和丙氨酸残基2种氨基酸构成的g/a单元30个单元以上，在其n末端侧包含含有15～25个丙氨酸残基的丙氨酸簇。
19、(14)根据(13)所述的制造方法，上述丙氨酸簇由序列号3或4所示的氨基酸序列构成。
20、(15)根据(13)或(14)所述的制造方法，上述重复单元是选自序列号8～16所示的氨基酸序列中的任意一种以上。
21、(16)根据(12)～(15)中任一项所述的制造方法，编码上述蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的基因由序列号17～25所示的任一碱基序列构成。
22、(17)一种基因组改造蚕，在蚕基因组内包含蓑蛾虫来源的丝心蛋白h链基因，在绢丝腺内生产该丝心蛋白h链蛋白质。
23、(18)根据(17)所述的基因组改造蚕，上述蓑蛾虫来源的丝心蛋白h链蛋白质是与蚕来源的丝心蛋白蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质。
24、(19)一种嵌合绢丝，是包含在蚕丝心蛋白h链蛋白质或l链蛋白质的任意位置连接有改造蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质的嵌合绢丝，上述改造蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质由3个以上相同和/或不同的重复单元连接而成，上述重复单元由全长120个～178个氨基酸构成，包含由甘氨酸残基和丙氨酸残基2种氨基酸残基构成的g/a单元30个单元以上，在其n末端侧包含含有15～25个丙氨酸残基的丙氨酸簇。
25、(20)根据(19)所述的嵌合绢丝，上述丙氨酸簇由序列号3或4所示的氨基酸序列构成。
26、(21)根据(19)或(20)所述的嵌合绢丝，上述重复单元是选自序列号8～16所示的氨基酸序列中的任意一种以上。
27、本说明书包含成为本技术的优先权的基础的日本专利申请号2022-056854号的公开内容。
1.基因组改造蚕的制作试剂盒，是生产包含蚕来源的丝心蛋白蛋白质与1种或多种其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质的基因组改造蚕的制作试剂盒，
2.根据权利要求1所述的制作试剂盒，所述供体载体从5’侧起为5’侧tale对应区域、3’侧同源区域、5’侧同源区域、和3’侧tale对应区域。
3.根据权利要求1或2所述的制作试剂盒，所述其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质为丝心蛋白h链蛋白质。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制作试剂盒，所述其它绢丝虫为蓑蛾虫。
5.根据权利要求4所述的制作试剂盒，蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质是3个以上相同和/或不同的重复单元连接而成的改造丝心蛋白h链蛋白质，
6.根据权利要求5所述的制作试剂盒，所述丙氨酸簇由序列号3或4所示的氨基酸序列构成。
7.根据权利要求5或6所述的制作试剂盒，所述重复单元是选自序列号8～16所示的氨基酸序列中的任意一种以上。
8.根据权利要求4～7中任一项所述的制作试剂盒，编码蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的基因由序列号17～25所示的任一碱基序列构成。
9.基因组改造蚕的制造方法，是生产包含蚕来源的丝心蛋白蛋白质与1种或多种其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质的基因组改造蚕的制造方法，包括下述工序：
10.根据权利要求9所述的制造方法，所述供体载体以所述其它绢丝虫丝心蛋白基因的正义链方向为基准从5’侧起按照5’侧tale对应区域、3’侧同源区域、5’侧同源区域、和3’侧tale对应区域的顺序配置。
11.根据权利要求9或10所述的制造方法，所述其它绢丝虫来源的丝心蛋白蛋白质为丝心蛋白h链蛋白质。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的制造方法，所述其它绢丝虫为蓑蛾虫。
13.根据权利要求12所述的制造方法，蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质是3个以上相同和/或不同的重复单元连接而成的改造丝心蛋白h链蛋白质，
14.根据权利要求13所述的制造方法，所述丙氨酸簇由序列号3或4所示的氨基酸序列构成。
15.根据权利要求13或14所述的制造方法，所述重复单元是选自序列号8～16所示的氨基酸序列中的任意一种以上。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的制造方法，编码所述蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的基因由序列号17～25所示的任一碱基序列构成。
17.一种基因组改造蚕，在蚕基因组内包含蓑蛾虫来源的丝心蛋白h链基因，在绢丝腺内生产该丝心蛋白h链蛋白质。
18.根据权利要求17所述的基因组改造蚕，所述蓑蛾虫来源的丝心蛋白h链蛋白质是与蚕来源的丝心蛋白蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质。
19.一种嵌合绢丝，是包含在蚕丝心蛋白h链蛋白质或l链蛋白质的任意位置连接有改造蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的嵌合丝心蛋白蛋白质的嵌合绢丝，
20.根据权利要求19所述的嵌合绢丝，所述丙氨酸簇由序列号3或4所示的氨基酸序列构成。
21.根据权利要求19或20所述的嵌合绢丝，所述重复单元是选自序列号8～16所示的氨基酸序列中的任意一种以上。
