在一些方面，本公开文本涉及在细胞组合物(包括工程化细胞组合物)的处理和制造中的连续逆流离心方法。在一些方面，连续逆流离心方法针对活细胞(如活t细胞)富集细胞组合物。还提供了所得的细胞组合物，如包含经基因工程化以表达抗原受体的t细胞的那些细胞组合物。在一些方面，通过连续逆流离心进行细胞组合物(如包含淋巴细胞群的组合物)的转导。在一些方面，本公开文本提供了用于转导细胞群的方法，所述方法涉及淋巴细胞和病毒载体颗粒的连续逆流离心，从而产生含有转导细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物能够用于过继细胞疗法的方法中。
背景技术：
1、有多种策略可用于体外富集和/或转导t细胞群，包括用于体外富集和转导抗原特异性t细胞以用于过继细胞免疫疗法或癌症疗法。体外富集和/或转导细胞群需要改进的策略，包括用于大规模研究、诊断和治疗目的。提供了满足此类需求的方法和相关组合物。
技术实现思路
1、本文提供了一种用于产生基因工程化t细胞的组合物的方法，所述方法包括(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床；(b)将病毒载体颗粒装载至所述圆锥形流体外壳中，从而生成包含所述细胞组合物和所述病毒载体颗粒的输入组合物；以及(c)将第二离心力和第二流速施加至所述输入组合物，其中所述第二离心力和所述第二流速使所述病毒载体颗粒在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而生成基因工程化t细胞。在一些实施方案中，所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
2、在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒的装载在(a)中的施加的至少一部分期间进行。在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒的装载在(c)中的施加的至少一部分期间进行。
3、本文还提供了一种用于产生基因工程化t细胞的组合物的方法，所述方法包括(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的输入组合物，以产生细胞流化床，所述输入组合物包含(i)病毒载体颗粒和(ii)含有t细胞的细胞组合物；以及(b)将第二离心力和第二流速施加至所述圆锥形流体外壳中的输入组合物，其中所述第二离心力和第二流速使所述病毒载体颗粒在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而生成基因工程化t细胞。在一些实施方案中，所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
4、在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞组合物和所述病毒载体颗粒装载至所述圆锥形流体外壳中，从而生成所述输入组合物。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在所述病毒载体颗粒的装载之前、期间和/或之后。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在所述病毒载体颗粒的装载之前。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在所述病毒载体颗粒的装载期间。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在所述病毒载体颗粒的装载之后。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载和/或所述病毒载体颗粒的装载在(a)中的施加之前和/或期间进行。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在(a)中的所述施加之前和/或期间进行。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在(a)中的所述施加之前进行。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在(a)中的所述施加期间进行。在一些实施方案中，所述细胞组合物的装载在(a)中的所述施加之前和期间进行。在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒的装载在(a)中的所述施加之前进行。在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒的装载在(a)中的所述施加期间进行。在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒的装载在(a)中的所述施加之前和期间进行。
5、在一些实施方案中，所述方法包括将第三离心力和第三流速施加至所述离心机系统的圆锥形流体外壳中的基因工程化t细胞，以产生包含所述基因工程化t细胞的输出组合物。
6、在一些实施方案中，所述输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，所述输出组合物中活t细胞的百分比比所述输入组合物中活t细胞的百分比大至少约5％、大至少约10％、大至少约15％、大至少约20％或大至少约25％。在一些实施方案中，所述输出组合物中活t细胞的百分比比所述输入组合物中活t细胞的百分比高约5％。在一些实施方案中，所述输出组合物中活t细胞的百分比比所述输入组合物中活t细胞的百分比高约10％。在一些实施方案中，所述输出组合物中活t细胞的百分比比所述输入组合物中活t细胞的百分比高约15％。
7、在一些实施方案中，所述输出组合物中至少或至少约5％、至少或至少约10％、至少或至少约15％、至少或至少约20％、至少或至少约25％、至少或至少约30％的t细胞被所述病毒载体颗粒转导。在一些实施方案中，所述输出组合物中至少约20％的t细胞被所述病毒载体颗粒转导。在一些实施方案中，所述输出组合物中至少约25％的t细胞被所述病毒载体颗粒转导。在一些实施方案中，所述输出组合物中至少约30％的t细胞被所述病毒载体颗粒转导。在一些实施方案中，所述输出组合物中至少约35％的t细胞被所述病毒载体颗粒转导。在一些实施方案中，所述输出组合物中至少约40％的t细胞被所述病毒载体颗粒转导。
8、在一些实施方案中，所述第一离心力在约2,000g与约4,000g之间。在一些实施方案中，所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间。在一些实施方案中，将所述第一离心力和所述第一流速施加至所述细胞组合物或所述输入组合物约15秒、约30秒、约45秒或约60秒。在一些实施方案中，将所述第一离心力和所述第一流速施加至所述细胞组合物或所述输入组合物约30秒。
9、在一些实施方案中，所述第二离心力在约500g与约1,500g之间。在一些实施方案中，所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。在一些实施方案中，将所述第二离心力和所述第二流速施加至输入组合物至少约15分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟、至少约75分钟或至少约90分钟。在一些实施方案中，将所述第二离心力和所述第二流速施加至所述输入组合物约30分钟。
10、在一些实施方案中，所述第二离心力在约500g与约1,500g之间。在一些实施方案中，所述第二流速在约10ml/min与约100ml/min之间。在一些实施方案中，将所述第二离心力和所述第二流速施加至输入组合物至少约15分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟、至少约75分钟或至少约90分钟。在一些实施方案中，将所述第二离心力和所述第二流速施加至所述输入组合物约30分钟。
11、在一些实施方案中，所述第二离心力在约100g与约2,000g之间。在一些实施方案中，所述第二流速在约10ml/min与约100ml/min之间。在一些实施方案中，将所述第二离心力和所述第二流速施加至输入组合物至少约15分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟、至少约75分钟或至少约90分钟。在一些实施方案中，将所述第二离心力和所述第二流速施加至所述输入组合物约30分钟。
12、在一些实施方案中，所述第一离心力与所述第一流速的比率在约200与约400之间。在一些实施方案中，所述第一离心力与所述第一流速的比率是约300。在一些实施方案中，所述第一离心力是约3,000g并且所述第一流速是约10ml/min。在一些实施方案中，所述第二离心力与所述第二流速的比率在约20与约100之间、在约25与约85之间或在约30与约65之间。在一些实施方案中，所述第二离心力与所述第二流速的比率是约35。在一些实施方案中，所述第二离心力是约1,000g并且所述第二流速是约28.5ml/min。在一些实施方案中，所述第二离心力与所述第二流速的比率是约62.5。
13、在一些实施方案中，所述第二离心力是约625g并且所述第二流速是约10ml/min。
14、在一些实施方案中，所述第二离心力与所述第二流速的比率是约30。在一些实施方案中，所述第二离心力是约300g并且所述第二流速是约10ml/min。
15、在一些实施方案中，所述第三离心力在约2,000g与约3,000g之间。在一些实施方案中，所述第三流速在约15ml/min与约25ml/min之间。在一些实施方案中，所述第三离心力与所述第三流速的比率在约100与约150之间。在一些实施方案中，所述第三离心力与所述第三流速的比率是约125。在一些实施方案中，所述第三离心力是约2,500g并且所述第三流速是约20ml/min。
16、在一些实施方案中，在施加所述第三离心力和所述第三流速之前，所述方法包括使所述基因工程化t细胞经受一个或多个洗涤步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个洗涤步骤包括培养基交换。在一些实施方案中，所述一个或多个洗涤步骤在所述第二离心力和所述第二流速下进行。
17、在一些实施方案中，所述方法包括在(a)中的所述施加之前在刺激条件下孵育所述细胞组合物的t细胞。在一些实施方案中，在(a)中的所述施加之前在刺激条件下孵育所述细胞组合物的t细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含激活的细胞。在一些实施方案中，所述刺激条件包括刺激试剂的存在，所述刺激试剂能够激活tcr复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域以及一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激试剂包含(i)与tcr复合物的成员特异性结合、任选地与cd3特异性结合的一级药剂，以及(ii)与t细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些实施方案中，所述一级药剂与cd3特异性结合。在一些实施方案中，所述二级药剂与选自cd28、cd137(4-1-bb)、ox40和icos的共刺激分子特异性结合。在一些实施方案中，所述二级药剂与cd28特异性结合。
18、在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂中的至少一种包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂各自包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述二级药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且所述二级药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂各自存在于或附着于固体支持物的表面上。在一些实施方案中，所述固体支持物是或包括珠。在一些实施方案中，所述固体支持物是表面附着有抗cd3和抗cd28抗体的顺磁珠。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂可逆地结合在包含多个链霉亲和素分子或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚体颗粒试剂的表面上。在一些实施方案中，所述链霉亲和素分子或所述链霉亲和素突变蛋白分子结合至或能够结合至生物素、抗生物素蛋白、生物素类似物或生物素突变蛋白、抗生物素蛋白类似物或抗生物素蛋白突变蛋白和/或其生物活性片段。在一些实施方案中，所述一级药剂包括抗cd3 fab，并且所述二级药剂包括抗cd28 fab。
19、在一些实施方案中，所述刺激条件包括一种或多种重组细胞因子的存在。在一些实施方案中，所述刺激条件包括重组il-2、il-7和il-15中的一种或多种的存在。
20、在一些实施方案中，所述方法包括收集所述输出组合物。在一些实施方案中，收集所述输出组合物。
21、在一些实施方案中，所述方法包括孵育所收集的输出组合物的基因工程化t细胞。在一些实施方案中，孵育所收集的输出组合物的基因工程化t细胞。在一些实施方案中，在所述收集后立即孵育所收集的输出组合物的基因工程化t细胞至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天或至少约20天。
22、在一些实施方案中，在收集后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天的所收集的输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，在收集后约1天的所收集的输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，在收集后约5天的所收集的输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。
23、在一些实施方案中，所述方法包括冷冻保存所收集的输出组合物和/或将所收集的输出组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括将所收集的输出组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的组合物。在一些实施方案中，将所收集的输出组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的组合物。在一些实施方案中，将冷冻保存的组合物解冻以产生解冻的组合物，并且所述解冻的组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，所述解冻的组合物中活t细胞的百分比比所述输入组合物中活t细胞的百分比大至少约5％、大至少约10％、大至少约15％、大至少约20％、大至少约25％或大至少约30％。
24、在一些实施方案中，所述输入组合物包含平均直径大于或大于约6微米、大于或大于约6微米、大于或大于约7微米、大于或大于约8微米、大于或大于约9微米、大于或大于约10微米或者大于或大于约11微米的t细胞。
25、在一些实施方案中，所述输入组合物包含在约1x 106个总t细胞与约2x 109个总t细胞之间。在一些实施方案中，所述输入组合物包含至少约1x 108个总t细胞、至少约2x 108个总t细胞、至少约3x 108个总t细胞、至少约4x108个总t细胞、至少约5x 108个总t细胞、至少约6x 108个总t细胞、至少约7x 108个总t细胞、至少约8x 108个总t细胞、至少约7x 108个总t细胞、至少约8x 108个总t细胞、至少约9x 108个总t细胞、至少约1x 109个总t细胞、至少约1.25x 109个总t细胞、至少约1.50x 109个总t细胞或至少约1.75x 109个总t细胞。在一些实施方案中，所述输入组合物的体积在约5ml与约20,000ml之间、在约10ml与约2,000ml之间、在约15ml与约1,000ml之间、在约20ml与约500ml与之间、在约25ml与约100ml之间或在约30ml与约60ml之间。在一些实施方案中，所述输入组合物的体积在约30ml与约60ml之间。在一些实施方案中，所述输入组合物的体积是约30ml。在一些实施方案中，所述输入组合物的体积是约60ml。
26、在一些实施方案中，所述输出组合物的体积在约2.5ml与约60ml之间、在约5ml与约40ml之间或在约10ml与约20ml之间。在一些实施方案中，所述输出组合物的体积是约5ml、约10ml、约15ml、约20ml、约25ml、约30ml、约35ml、约40ml、约45ml、约50ml、约55ml或约60ml。
27、在一些实施方案中，所述方法的一个或多个步骤是自动化的。在一些实施方案中，所述方法的一个或多个步骤通过离心机系统或其组件自动化。
28、在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒包含编码重组分子的异源核酸。在一些实施方案中，所述重组分子是趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、抗原受体(例如，car或tcr)或其组合。在一些实施方案中，所述重组分子是抗原受体。在一些实施方案中，所述抗原受体是转基因t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，是嵌合抗原受体(car)。
29、在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(car)包含与靶抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ(cd3ζ)链的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述car进一步包含连接所述细胞外结构域和所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含cd28的跨膜部分。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域进一步包含t细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述t细胞共刺激分子选自cd28和4-1bb。在一些实施方案中，所述car被重组表达。在一些实施方案中，所述car由载体表达。在一些实施方案中，所述car由γ逆转录病毒载体或慢病毒载体表达。在一些实施方案中，所述car由慢病毒载体表达。
30、在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒是γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒是慢病毒载体颗粒。
31、在一些实施方案中，所述抗原受体特异性结合与疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或障碍、和/或感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述t细胞是原代t细胞，任选地来自人受试者。
32、本文还提供了一种用于针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床，其中所述细胞组合物包含活t细胞和非活t细胞，以及(b)将第二离心力和第二流速施加至所述细胞组合物，其中所述第二离心力和所述第二流速使所述细胞组合物的细胞在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而从所述圆锥形流体外壳中淘洗出所述细胞组合物的废物级分，所述废物级分具有比所述细胞组合物中非活t细胞百分比更高的非活t细胞百分比，并且在所述圆锥形流体外壳内产生具有比所述细胞组合物中活t细胞百分比更高的活t细胞百分比的经富集的组合物。在一些实施方案中，所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
33、在一些实施方案中，(i)所述第一离心力在约1,000g与约4,000g之间；并且(ii)所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间。
34、在一些实施方案中，所述第一离心力(以g计)与所述第一流速(以ml/min计)的比率在约200与约500之间。在一些实施方案中，所述第一离心力(以g计)与所述第一流速(以ml/min计)的比率在约200与约400之间。
35、在一些实施方案中，将所述第一离心力和所述第一流速施加至所述细胞组合物至少30秒。
36、在一些实施方案中，所述第二离心力在约350g与约4,000g之间；并且(ii)所述第二流速在约5ml/min与约100ml/min之间。
37、在一些实施方案中，所述第二离心力在约350g与3,000g之间。在一些实施方案中，所述第二离心力在约1,500g与约3,000g之间。在一些实施方案中，所述第二离心力在约500g与约1,500g之间。
38、在一些实施方案中，所述第二流速在约65ml/min与约100ml/min之间。
39、在一些实施方案中，所述第二流速在约10ml/min与约65ml/min之间。在一些实施方案中，所述第二流速在约10ml/min与约35ml/min之间。
40、在一些实施方案中，所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。
41、在一些实施方案中，所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约70之间。在一些实施方案中，所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间。
42、在一些实施方案中，所述t细胞具有约9μm至约20μm的平均直径。在一些实施方案中，所述t细胞具有小于9μm的平均直径。在一些实施方案中，所述t细胞具有约6μm至约9μm的平均直径。
43、在一些实施方案中，所述t细胞具有约9μm至约20μm的平均直径。在一些实施方案中，所述t细胞具有约9μm至约20μm的平均直径，并且所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约70之间。
44、在一些实施方案中，所述t细胞具有约10μm至约20μm的平均直径。在一些实施方案中，所述t细胞具有约12μm至约20μm的平均直径。在一些实施方案中，所述t细胞具有约14μm至约20μm的平均直径。
45、在一些实施方案中，所述t细胞具有小于9μm的平均直径，并且所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间。
46、本文还提供了一种针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床，其中所述细胞组合物包含活t细胞和非活t细胞，其中(i)所述第一离心力在约2,000g与约4,000g之间；并且(ii)所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间；以及(b)将第二离心力和第二流速施加至所述细胞组合物，其中所述第二离心力和所述第二流速使所述细胞组合物的细胞在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而生成具有比所述细胞组合物中活t细胞百分比更高的活t细胞百分比的经富集的组合物，其中(i)所述第二离心力在约1,500g与约3,000g之间；(ii)所述第二流速在约65ml/min与约100ml/min之间；并且(iii)所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间；其中所述t细胞具有小于9μm的平均直径。
47、在一些实施方案中，所述方法包括收集所淘洗的废物级分。在一些实施方案中，将所淘洗的废物级分收集在与所述圆锥形流体外壳的宽端流体连通的容器中。
48、本文还提供了一种用于针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床，其中所述细胞组合物包含活t细胞和非活t细胞，以及(b)将第二离心力和第二流速施加至所述细胞组合物，其中所述第二离心力和所述第二流速使所述细胞组合物的细胞在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而从所述圆锥形流体外壳中淘洗出所述细胞组合物的废物级分，所述废物级分具有比所述细胞组合物中非活t细胞百分比更高的非活t细胞百分比，并且在所述圆锥形流体外壳内生成具有比所述细胞组合物中活t细胞百分比更高的活t细胞百分比的经富集的组合物，其中所述细胞组合物包含被冷冻保存并在应用所述方法之前被解冻的t细胞。在一些实施方案中，所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
49、本文还提供了一种用于针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床，其中所述细胞组合物包含活t细胞和非活t细胞，(b)将第二离心力和第二流速施加至所述细胞组合物，其中所述第二离心力和第二流速使所述细胞组合物的细胞在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而从所述圆锥形流体外壳中淘洗出所述细胞组合物的废物级分，所述废物级分具有比所述细胞组合物中非活t细胞百分比更高的非活t细胞百分比，并且在所述圆锥形流体外壳内生成具有比所述细胞组合物中活t细胞百分比更高的活t细胞百分比的经富集的组合物，以及(c)在步骤(a)和(b)之后将所述经富集的组合物的细胞冷冻保存，以产生冷冻保存的细胞组合物。在一些实施方案中，所述方法包括(d)在步骤(c)之后将所述冷冻保存的细胞组合物解冻。在一些实施方案中，所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
50、本文还提供了一种针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床，其中所述细胞组合物包含活t细胞和非活t细胞，以及(b)将第二离心力和第二流速施加至所述细胞组合物，其中所述第二离心力和所述第二流速使所述细胞组合物的细胞在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而生成具有比所述细胞组合物中活t细胞百分比更高的活t细胞百分比的经富集的组合物。在一些实施方案中，所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
51、在一些实施方案中，所述方法包括收集所淘洗的废物级分。在一些实施方案中，将所淘洗的废物级分收集在与所述圆锥形流体外壳的宽端流体连通的容器中。
52、在一些实施方案中，所述第二流速是30ml/min或更小。在一些实施方案中，所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。
53、本文还提供了一种针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)将第一离心力和第一流速施加至离心机系统的圆锥形流体外壳中的包含t细胞的细胞组合物，以产生细胞流化床，其中所述细胞组合物包含活t细胞和非活t细胞，其中(i)所述第一离心力在约2,000g与约4,000g之间；并且(ii)所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间；以及(b)将第二离心力和第二流速施加至所述细胞组合物，其中所述第二离心力和所述第二流速使所述细胞组合物的细胞在所述离心机系统的流体路径中再循环，从而生成具有比所述细胞组合物中活t细胞百分比更高的活t细胞百分比的经富集的组合物，其中(i)所述第二离心力在约500g与约1,500g之间；并且(ii)所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。
54、在一些实施方案中，所述细胞组合物包含冷冻保存并在应用所述方法之前解冻的t细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将冷冻保存的细胞组合物解冻以产生包含t细胞的细胞组合物。
55、在一些实施方案中，所述第二离心力在约700g与约1,300g之间。在一些实施方案中，所述第二离心力在约800g与约1,200g之间。在一些实施方案中，所述第二离心力在约900g与约1,100g之间。在一些实施方案中，所述第二离心力是约1,000g。
56、在一些实施方案中，所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间。
57、在一些实施方案中，(i)所述第一离心力在约2,000g与约4,000g之间；并且(ii)所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间。在一些实施方案中，(i)所述第二离心力在约500g与约1,500g之间；并且(ii)所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞组合物装载至所述离心机系统中。在一些实施方案中，所述装载在(a)中的所述施加的至少一部分之前和/或期间进行。在一些实施方案中，所述装载在(a)中的所述施加之前进行。在一些实施方案中，所述装载在(a)中的所述施加的至少一部分期间进行。在一些实施方案中，所述装载在(a)中的所述施加的至少一部分之前和期间进行。
58、在一些实施方案中，在(a)中的所述施加之前，所述方法包括使所述细胞组合物的t细胞与病毒载体颗粒接触，从而产生基因工程化t细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物的t细胞已经与病毒载体颗粒接触，从而产生基因工程化t细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物的t细胞是基因工程化t细胞。
59、在一些实施方案中，所述经富集的组合物中活t细胞的百分比比所述细胞组合物中活t细胞的百分比大至少约10％、大至少约20％、大至少约30％、大至少约40％、大至少约50％或大至少约60％。
60、在一些实施方案中，所述方法包括(c)将第三离心力和第三流速施加至所述离心机系统的圆锥形流体外壳中的经富集的组合物，以收集所述经富集的组合物。在一些实施方案中，(i)所述第三离心力在约2,000g与约3,000g之间；并且(ii)所述第三流速在约15ml/min与约25ml/min之间。在一些实施方案中，在施加所述第三离心力和所述第三流速之前，所述方法包括使所述经富集的组合物经受一个或多个洗涤步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个洗涤步骤包括培养基交换。在一些实施方案中，所述一个或多个洗涤步骤在所述第二离心力和所述第二流速下进行。
61、在一些实施方案中，在收集后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天的所收集的经富集的组合物中活t细胞的百分比大于所述细胞组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，在收集后约1天的所收集的经富集的组合物中活t细胞的百分比大于所述细胞组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，在收集后约5天的所收集的经富集的组合物中活t细胞的百分比大于所述细胞组合物中活t细胞的百分比。
62、在一些实施方案中，所述方法包括在(a)中的所述施加之前在刺激条件下孵育所述细胞组合物的t细胞。在一些实施方案中，在(a)中的所述施加之前在刺激条件下孵育所述细胞组合物的t细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含激活的细胞。在一些实施方案中，所述刺激条件包括刺激试剂的存在，所述刺激试剂能够激活tcr复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域以及一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述刺激试剂包含(i)与tcr复合物的成员特异性结合、任选地与cd3特异性结合的一级药剂，以及(ii)与t细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂。在一些实施方案中，所述一级药剂与cd3特异性结合。在一些实施方案中，所述二级药剂与选自cd28、cd137(4-1-bb)、ox40和icos的共刺激分子特异性结合。在一些实施方案中，所述二级药剂与cd28特异性结合。
63、在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂中的至少一种包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂各自包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述二级药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且所述二级药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂各自存在于或附着于固体支持物的表面上。在一些实施方案中，所述固体支持物是或包括珠。在一些实施方案中，所述固体支持物是表面附着有抗cd3和抗cd28抗体的顺磁珠。在一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂可逆地结合在包含多个链霉亲和素分子或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚体颗粒试剂的表面上。在一些实施方案中，所述链霉亲和素分子或所述链霉亲和素突变蛋白分子结合至或能够结合至生物素、抗生物素蛋白、生物素类似物或生物素突变蛋白、抗生物素蛋白类似物或抗生物素蛋白突变蛋白和/或其生物活性片段。在一些实施方案中，所述一级药剂包括抗cd3 fab，并且所述二级药剂包括抗cd28 fab。
64、在一些实施方案中，所述刺激条件包括一种或多种重组细胞因子的存在。在一些实施方案中，所述刺激条件包括重组il-2、il-7和il-15中的一种或多种的存在。在一些实施方案中，所述细胞组合物包含激活的t细胞。
65、在一些实施方案中，所述方法包括将所收集的经富集的组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的经富集的组合物。在一些实施方案中，将所收集的经富集的组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的经富集的组合物。在一些实施方案中，将冷冻保存的经富集的组合物解冻以产生解冻的经富集的组合物，并且所述解冻的经富集的组合物中活t细胞的百分比大于所述细胞组合物中活t细胞的百分比。在一些实施方案中，所述解冻的经富集的组合物中活t细胞的百分比比所述细胞组合物中活t细胞的百分比大至少约5％、大至少约10％、大至少约15％、大至少约20％、大至少约25％或大至少约30％。
66、在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(a)和(b)的应用之后将所述经富集的组合物的细胞冷冻保存，以产生冷冻保存的细胞组合物。在一些实施方案中，所述冷冻保存包括将所述细胞悬浮在包含冷冻保护剂的培养基中并冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述冷冻在速率受控的冷冻器中进行。
67、在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述冷冻保存的细胞组合物解冻。在一些实施方案中，在所述冷冻保存的细胞组合物已冷冻至少3天后进行所述解冻。
68、在一些实施方案中，所述方法的一个或多个步骤是自动化的。在一些实施方案中，所述方法的一个或多个步骤通过离心机系统或其组件自动化。
69、在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒包含编码重组分子的异源核酸。在一些实施方案中，所述重组分子是趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、抗原受体(例如，car或tcr)或其组合。在一些实施方案中，所述重组分子是抗原受体。在一些实施方案中，所述抗原受体是转基因t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，是嵌合抗原受体(car)。
70、在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体(car)包含与靶抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包含免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ(cd3ζ)链的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述car进一步包含连接所述细胞外结构域和所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含cd28的跨膜部分。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域进一步包含t细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述t细胞共刺激分子选自cd28和4-1bb。在一些实施方案中，所述car被重组表达。在一些实施方案中，所述car由载体表达。在一些实施方案中，所述car由γ逆转录病毒载体或慢病毒载体表达。在一些实施方案中，所述car由慢病毒载体表达。
71、在一些实施方案中，所述病毒载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒是γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒是慢病毒载体颗粒。
72、在一些实施方案中，所述抗原受体特异性结合与疾病或病症相关的抗原。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或障碍、和/或感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述t细胞是原代t细胞，任选地来自人受试者。
73、本文提供了通过本文所提供的任何方法产生的包含基因工程化t细胞的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含在约1.0x 106个car表达t细胞与2.0x 109个car表达t细胞之间。在一些实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物包含冷冻保护剂。
74、本文提供了一种治疗患有疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括将本文所提供的任何组合物施用于所述受试者。本文提供了本文所提供的任何组合物用于治疗受试者的疾病或障碍的用途。本文提供了用于治疗受试者的疾病或障碍的本文所提供的任何组合物。在一些实施方案中，所述基因工程化细胞被工程化以表达特异性结合与疾病或障碍相关的抗原的抗原受体。
1.一种用于产生基因工程化t细胞的组合物的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒载体颗粒的所述装载在(a)中的所述施加的至少一部分期间进行和/或在(c)中的所述施加的至少一部分期间进行。
3.一种用于产生基因工程化t细胞的组合物的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括将所述细胞组合物和所述病毒载体颗粒装载至所述圆锥形流体外壳中，从而生成所述输入组合物，其中所述细胞组合物的装载在所述病毒载体颗粒的装载之前、期间和/或之后。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞组合物的装载和/或所述病毒载体颗粒的装载在(a)中的所述施加之前和/或期间进行。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将第三离心力和第三流速施加至所述离心机系统的圆锥形流体外壳中的所述基因工程化t细胞，以产生包含所述基因工程化t细胞的输出组合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比，任选地大至少约5％、大至少约10％、大至少约15％、大至少约20％或大至少约25％。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述输出组合物中至少或至少约5％、至少或至少约10％、至少或至少约15％、至少或至少约20％、至少或至少约25％或至少或至少约30％的所述t细胞被所述病毒载体颗粒转导。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中(i)所述第一离心力在约2,000g与约4,000g之间；并且(ii)所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间，任选地其中将所述第一离心力和所述第一流速施加至所述细胞组合物或所述输入组合物约15秒、约30秒、约45秒或约60秒。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中(i)所述第二离心力在约500g与约1,500g之间；并且(ii)所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一离心力(以g计)与所述第一流速(以ml/min计)的比率在约200与约400之间。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第一离心力(以g计)与所述第一流速(以ml/min计)的比率是约300。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第一离心力是约3,000g，并且所述第一流速是约10ml/min。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约20与约100之间、在约25与约85之间或在约30与约65之间。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率是约35。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第二离心力是约1,000g，并且所述第二流速是约28.5ml/min。
18.根据权利要求1-10和12-16中任一项所述的方法，其中(i)所述第二离心力在约500g与约1,500g之间；并且(ii)所述第二流速在约10ml/min与约100ml/min之间。
19.根据权利要求1-15和18中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率是约62.5。
20.根据权利要求1-10、12-15、18和19中任一项所述的方法，其中所述第二离心力是约625g，并且所述第二流速是约10ml/min。
21.根据权利要求1-10、12-16和19中任一项所述的方法，其中(i)所述第二离心力在约100g与约2,000g之间；并且(ii)所述第二流速在约10ml/min与约100ml/min之间。
22.根据权利要求1-15、18和21中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率是约30。
23.根据权利要求1-10、12-15、21和22中任一项所述的方法，其中所述第二离心力是约300g，并且所述第二流速是约10ml/min。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中将所述第二离心力和所述第二流速施加至所述输入组合物至少约15分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约60分钟、至少约75分钟或至少约90分钟。
25.根据权利要求7-24中任一项所述的方法，其中(i)所述第三离心力在约2,000g与约3,000g之间；并且(ii)所述第三流速在约15ml/min与约25ml/min之间。
26.根据权利要求7-25中任一项所述的方法，其中所述第三离心力(以g计)与所述第三流速(以ml/min计)的比率在约100与约150之间，任选地其中所述第三离心力(以g计)与所述第三流速(以ml/min计)的比率是约125。
27.根据权利要求7-26中任一项所述的方法，其中所述第三离心力是约2,500g，并且所述第三流速是约20ml/min。
28.根据权利要求7-27中任一项所述的方法，其中在施加所述第三离心力和所述第三流速之前，所述方法包括使所述基因工程化t细胞经受一个或多个洗涤步骤，任选地其中所述一个或多个洗涤步骤包括培养基交换。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述方法包括在(a)中的所述施加之前将所述细胞组合物的t细胞在刺激条件下孵育和/或将所述细胞组合物的t细胞在(a)中的所述施加之前在刺激条件下孵育。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述刺激条件包括刺激试剂的存在，所述刺激试剂能够激活tcr复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述刺激试剂包含(i)与tcr复合物的成员特异性结合、任选地与cd3特异性结合的一级药剂，以及(ii)与t细胞共刺激分子特异性结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自cd28、cd137(4-1-bb)、ox40和icos。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂中的至少一种包含抗体或其抗原结合片段。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述一级药剂是抗cd3抗体或其抗原结合片段，并且所述二级药剂是抗cd28抗体或其抗原结合片段。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂各自存在于固体支持物的表面上，任选地其中所述一级药剂和所述二级药剂各自存在于珠的表面上，进一步任选地存在于顺磁珠的表面上。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂可逆地结合在包含多个链霉亲和素分子或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚体颗粒试剂的表面上。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述链霉亲和素分子或所述链霉亲和素突变蛋白分子结合或能够结合生物素或生物素类似物。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述一级药剂包括抗cd3 fab，并且所述二级药剂包括抗cd28 fab。
38.根据权利要求29-37中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括一种或多种重组细胞因子的存在。
39.根据权利要求29-38中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括重组il-2、il-7和il-15中的一种或多种的存在。
40.根据权利要求7-39中任一项所述的方法，其中所述方法包括收集所述输出组合物和/或将所述输出组合物收集。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括孵育所收集的输出组合物的基因工程化t细胞和/或将所收集的输出组合物的基因工程化t细胞孵育。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中将所收集的输出组合物的基因工程化t细胞在所述收集后立即孵育至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天或至少约20天。
43.根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中在收集后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天的所收集的输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中在收集后约1天的所收集的输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中在收集后约5天的所收集的输出组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中所述方法包括冷冻保存所收集的输出组合物和/或将所收集的输出组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的组合物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中将所述冷冻保存的组合物解冻以产生解冻的组合物，并且所述解冻的组合物中活t细胞的百分比大于所述输入组合物中活t细胞的百分比，任选地大至少约5％、大至少约10％、大至少约15％、大至少约20％、大至少约25％或大至少约30％。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含具有如下平均直径的t细胞：大于或大于约6微米、大于或大于约6微米、大于或大于约7微米、大于或大于约8微米、大于或大于约9微米、大于或大于约10微米或大于或大于约11微米。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含在约1x106个总t细胞与约2x 109个总t细胞之间。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述输入组合物包含至少约1x 108个总t细胞、至少约2x 108个总t细胞、至少约3x 108个总t细胞、至少约4x 108个总t细胞、至少约5x 108个总t细胞、至少约6x 108个总t细胞、至少约7x 108个总t细胞、至少约8x 108个总t细胞、至少约7x 108个总t细胞、至少约8x 108个总t细胞、至少约9x 108个总t细胞、至少约1x 109个总t细胞、至少约1.25x 109个总t细胞、至少约1.50x 109个总t细胞或至少约1.75x109个总t细胞。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述输入组合物的体积在约5ml与约20,000ml之间、在约10ml与约2,000ml之间、在约15ml与约1,000ml之间、在约20ml与约500ml之间、在约25ml与约100ml之间或在约30ml与约60ml之间。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述输入组合物的体积在约30ml与约60ml之间。
53.根据权利要求7-52中任一项所述的方法，其中所述输出组合物的体积在约2.5ml与约60ml之间、在约5ml与约40ml之间或在约10ml与约20ml之间。
54.根据权利要求7-53中任一项所述的方法，其中所述输出组合物的体积是约5ml、约10ml、约15ml、约20ml、约25ml、约30ml、约35ml、约40ml、约45ml、约50ml、约55ml或约60ml。
55.一种用于针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：
56.根据权利要求55所述的方法，其中(i)所述第一离心力在约1,000g与约4,000g之间；并且(ii)所述第一流速在约5ml/min与约15ml/min之间。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述第一离心力(以g计)与所述第一流速(以ml/min计)的比率在约200与约500之间。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述第一离心力(以g计)与所述第一流速(以ml/min计)的比率在约200与约400之间。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中将所述第一离心力和所述第一流速施加至所述细胞组合物至少30秒。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的方法，其中(i)所述第二离心力在约350g与约4,000g之间；并且(ii)所述第二流速在约5ml/min与约100ml/min之间。
61.根据权利要求55-60中任一项所述的方法，其中所述第二离心力在约350g与3,000g之间。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述第二离心力在约1,500g与约3,000g之间。
63.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述第二离心力在约500g与约1,500g之间。
64.根据权利要求55-63中任一项所述的方法，其中所述第二流速在约65ml/min与约100ml/min之间。
65.根据权利要求55-63中任一项所述的方法，其中所述第二流速在约10ml/min与约65ml/min之间。
66.根据权利要求55-63和65中任一项所述的方法，其中所述第二流速在约10ml/min与约35ml/min之间。
67.根据权利要求55-63、65和66中任一项所述的方法，其中所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。
68.根据权利要求55-67中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约70之间。
69.根据权利要求55-68中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述t细胞具有约9μm至约20μm的平均直径。
71.根据权利要求55-68和70中任一项所述的方法，其中所述t细胞具有约9μm至约20μm的平均直径，并且所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约70之间。
72.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述t细胞具有小于9μm的平均直径。
73.根据权利要求55-69和72中任一项所述的方法，其中所述t细胞具有小于9μm的平均直径，并且所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间。
74.一种针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：
75.根据权利要求1-69和72-74中任一项所述的方法，其中所述t细胞具有约6μm至约9μm的平均直径。
76.根据权利要求55-75中任一项所述的方法，其中所述方法包括收集所淘洗的废物级分。
77.根据权利要求76所述的方法，其中将所淘洗的废物级分收集在与所述圆锥形流体外壳的宽端流体连通的容器中。
78.一种用于针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：
79.根据权利要求78所述的方法，所述方法进一步包括(d)在步骤(c)之后将所述冷冻保存的细胞组合物解冻。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中所述第二流速是30ml/min或更小。
81.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中所述第二流速在约25ml/min与约30ml/min之间。
82.一种针对活细胞富集细胞组合物的方法，所述方法包括：
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述t细胞具有约9μm至约20μm的平均直径。
84.根据权利要求82或权利要求83所述的方法，其中所述方法包括在步骤(a)和(b)的应用之后将所述经富集的组合物的细胞冷冻保存，以产生冷冻保存的细胞组合物。
85.根据权利要求78-81和84中任一项所述的方法，其中所述冷冻保存包括将所述细胞悬浮在包含冷冻保护剂的培养基中并冷冻所述细胞，任选地其中所述冷冻在速率受控的冷冻器中进行。
86.根据权利要求78-81、84和85中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述冷冻保存的细胞组合物解冻，任选地其中在所述冷冻保存的细胞组合物已经冷冻至少3天之后进行所述解冻。
87.根据权利要求78-86中任一项所述的方法，其中所述第二离心力在约700g与约1,300g之间。
88.根据权利要求78-87中任一项所述的方法，其中所述第二离心力在约800g与约1,200g之间。
89.根据权利要求78-88中任一项所述的方法，其中所述第二离心力在约900g与约1,100g之间。
90.根据权利要求78-89中任一项所述的方法，其中所述第二离心力是约1,000g。
91.根据权利要求78-90中任一项所述的方法，其中所述第二离心力(以g计)与所述第二流速(以ml/min计)的比率在约30与约40之间。
92.根据权利要求55-91中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述细胞组合物装载至所述离心机系统中，其中所述装载在(a)中的所述施加的至少一部分之前和/或期间进行。
93.根据权利要求55-92中任一项所述的方法，其中所述离心机系统是连续逆流离心机系统。
94.根据权利要求55-93中任一项所述的方法，其中在(a)中的所述施加之前，所述方法包括使所述细胞组合物的t细胞与病毒载体颗粒接触，从而产生基因工程化t细胞，和/或所述细胞组合物的t细胞已经与病毒载体颗粒接触，从而产生基因工程化t细胞。
95.根据权利要求55-94中任一项所述的方法，其中所述经富集的组合物中活t细胞的百分比比所述细胞组合物中活t细胞的百分比大至少约10％、大至少约20％、大至少约30％、大至少约40％、大至少约50％或大至少约60％。
96.根据权利要求55-95中任一项所述的方法，所述方法包括(c)将第三离心力和第三流速施加至所述离心机系统的圆锥形流体外壳中的所述经富集的组合物以收集所述经富集的组合物，其中(i)所述第三离心力在约2,000g与约3,000g之间；并且(ii)所述第三流速在约15ml/min与约25ml/min之间。
97.根据权利要求96所述的方法，其中在所述施加所述第三离心力和所述第三流速之前，所述方法包括使所述经富集的组合物经受一个或多个洗涤步骤，任选地其中所述一个或多个洗涤步骤包括培养基交换。
98.根据权利要求28-54和96中任一项所述的方法，其中所述一个或多个洗涤步骤在所述第二离心力和所述第二流速下进行。
99.根据权利要求1-98中任一项所述的方法，其中所述细胞组合物包含激活的t细胞。
100.根据权利要求55-99中任一项所述的方法，其中所述方法包括冷冻保存所收集的经富集的组合物和/或将所收集的经富集的组合物冷冻保存，从而生成冷冻保存的经富集的组合物。
101.根据权利要求100所述的方法，其中将所述冷冻保存的经富集的组合物解冻以产生解冻的经富集的组合物，并且所述解冻的经富集的组合物中活t细胞的百分比大于所述细胞组合物中活t细胞的百分比，任选地大至少约5％、大至少约10％、大至少约15％、大至少约20％、大至少约25％或大至少约30％。
102.根据权利要求1-101中任一项所述的方法，其中所述方法的一个或多个步骤是自动化的，任选地其中所述方法的所述一个或多个步骤通过所述离心机系统或其组件自动化。
103.根据权利要求1-54和94-102中任一项所述的方法，其中所述病毒载体颗粒包含编码重组分子的异源核酸。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述重组分子是趋化因子、趋化因子受体、细胞因子、细胞因子受体、抗原受体或其组合。
105.根据权利要求103或权利要求104所述的方法，其中所述重组分子是抗原受体。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述抗原受体是转基因t细胞受体(tcr)。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述抗原受体是嵌合抗原受体(car)。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(car)包含与靶抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域和含有免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的细胞内信号传导结构域。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域包含cd3-ζ(cd3ζ)链的细胞内结构域。
110.根据权利要求108或权利要求109所述的方法，其中所述car进一步包含连接所述细胞外结构域和所述细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述跨膜结构域包含cd28的跨膜部分。
112.根据权利要求108-111中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含t细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述t细胞共刺激分子选自cd28和4-1bb。
114.根据权利要求1-54和94-113中任一项所述的方法，其中所述病毒载体颗粒是逆转录病毒载体颗粒。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述逆转录病毒载体颗粒是γ逆转录病毒载体。
116.根据权利要求114所述的方法，其中所述逆转录病毒载体颗粒是慢病毒载体颗粒。
117.根据权利要求105-116中任一项所述的方法，其中所述抗原受体特异性结合与疾病或病症相关的抗原。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病或障碍和/或感染性疾病。
119.根据权利要求117或权利要求118所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
120.根据权利要求1-119中任一项所述的方法，其中所述t细胞是原代t细胞，任选地来自人受试者。
121.一种组合物，所述组合物包含通过根据权利要求1-120中任一项所述的方法产生的基因工程化t细胞。
122.根据权利要求121所述的组合物，其中所述组合物包含在约1.0x 106个car表达t细胞与2.0x 109个car表达t细胞之间。
123.根据权利要求121或权利要求122所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
124.根据权利要求121或权利要求122所述的组合物，所述组合物进一步包含冷冻保护剂。
125.一种治疗患有疾病或障碍的受试者的方法，所述方法包括将根据权利要求121-123中任一项所述的组合物施用于所述受试者。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述基因工程化t细胞表达特异性结合与所述疾病或障碍相关的抗原的抗原受体。
