本发明涉及组织工程改造构建体及其制造方法。
背景技术：
1、由骨骼损伤、疾病或先天性病症引起的大骨缺损的再生仍然是重大临床问题。美国和全球每年分别进行超过50万和200万例骨移植手术。自体同源骨是骨移植的金标准。然而，需要额外手术从供体部位获得自体同源骨，所能获得的骨的数量限制了大缺损重建可能使得供体部位发生病变。同种异体移植物已广泛用于替代自体同源移植物用于骨再生。然而，由于各种并发症，同种异体移植物在治疗大型严重骨缺损方面的长期失败率为25％～60％。此外，据美国疾病控制和预防中心(cdc)称，使用冷冻同种异体移植物存在潜在的疾病传播风险。市售可得的脱矿质骨基质(dbm)含有骨诱导因子，但dbm本身无法为大型骨缺损的重建提供结构和机械支撑。因此，合成支架作为骨移植物替代品近年来引起了人们的关注。
2、用于骨组织工程改造的理想支架具有生物相容性、生物可吸收性、机械稳定性、多孔性、骨传导性和骨诱导性。生物相容、生物可吸收且经fda批准的聚酯包括聚己内酯(pcl)、聚乙醇酸(pga)和聚乳酸(pla)及其共聚物(例如plga)，是骨组织工程改造中最广泛使用的合成聚合物。人们已采用多种方法制造多孔聚酯基支架，例如模塑、溶剂浇铸/致孔剂浸出、气体发泡、激光钻孔和3d打印。在这些技术中，3d打印精确控制支架的结构和孔隙率。3d打印支架的孔隙率受控良好对于骨组织工程改造尤为重要，因为互相连通且单个孔径大于300μm的孔对于细胞迁移和骨长入至关重要。
3、聚酯基支架的骨传导性和机械性能通过纳入磷酸钙生物陶瓷得到增强。例如，小鼠前成骨细胞(mc3t3-e1)在3d打印的pcl/β-磷酸三钙(tcp)基质的成骨分化显著高于原始pcl基质。发明人先前已证明，通过改变tcp含量和支架孔隙率，3d打印的pcl-tcp支架的杨氏模量(young’s modulus)在12至188mpa范围内可调。此外，临床上可用的电子束灭菌对pcl-tcp支架的机械性质和生物活性不会产生不利影响。
4、尽管3d打印的聚合物/陶瓷支架具有生物相容性、生物可吸收性、机械稳定性、多孔性和骨传导性，但它们缺少刺激成骨分化和加速骨愈合的骨诱导因子。因此，需要将骨诱导蛋白纳入3d的打印支架中，特别是对于治疗大型骨缺损。表面涂层已用于将蛋白质固定在组织工程改造应用的3d打印的支架表面。然而，薄涂层上的蛋白质加载通常有限且快速释放。例如，相比未涂覆的支架，通过逐层(lbl)沉积加载到涂覆壳聚糖和透明质酸钠的3d打印的羟基磷灰石基支架上的bsa更少且更快释放。
5、水凝胶已用于组织工程改造应用中的蛋白质递送或细胞封装。含水量大的3d聚合物水凝胶网络为蛋白质的充分加载和持续释放提供了平台。然而，水凝胶的刚度和结构完整性较差，限制了它们作为独立3d支架的使用。此外，由于界面处的机械性能不匹配，将软水凝胶纳入刚性3d打印的支架具有挑战性。用水凝胶前体溶液填充多孔3d打印的支架后进行光或热诱导凝胶化已用于将水凝胶纳入刚性支架。例如，使用表面张力辅助方法向3d打印的构建体的孔填充光交联甲基丙烯酸酯化明胶水凝胶。多材料3d打印已用于制造多孔聚合物/水凝胶复合支架。
6、在组织工程改造应用中，纳入水凝胶后保持支架的多孔结构对于扩散营养物质和氧气的细胞迁移、组织整合和血管化至关重要。集成组织器官打印机用于依次打印明胶/纤维蛋白原基水凝胶以及pcl结构支撑。斯坦福大学开发了一种3d混合生物打印技术(hybprinter)并将其用于打印由pcl和聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda)水凝胶制成的复合支架。尽管多材料打印具有技术意义，但由于打印过程中材料之间需要多次迭代，因此需要较长的制造时间，并且需要专门的昂贵3d打印机。此外，同时打印聚合物/陶瓷和水凝胶会阻碍支架表面处理和改善界面处软硬材料整合。
技术实现思路
1、本发明在一个实例中提供了一种多孔或无孔加载生物制剂的多材料构建体，以下称之为混合组织工程改造构建体(hytec)，用于再生医学和疾病治疗。
2、由多孔或无孔形式的聚合物、陶瓷、金属或复合物制成的构建体和装置已广泛用作再生医学中的植入物。包括3d打印和铸造在内的多种技术已用于制造多孔植入物。此外，包括逐层涂覆或粘合剂涂覆在内的涂覆技术已用于将生物分子加载到多孔植入物的表面。然而，这些涂覆技术仅允许加载有限量的生物分子。在植入物上加载大量或可调剂量的生物分子尤为重要，因为生物分子在体内的有效剂量通常很高，并且可能因各种适应症而不同。
3、生物制剂(生物分子、药物和/或细胞)可以通过用载有生物制剂的水凝胶填充植入物的多孔结构加载于植入物。然而，用水凝胶填充植入物的多孔空间会封闭孔隙，并抑制或减少细胞募集和迁移、血管侵袭、组织再生和与周围组织的整合。
4、为了至少解决这一问题，本发明的发明人已经开发出一种策略来设计hytec，该策略能够将生物制剂通过均匀厚的水凝胶层纳入多孔支架并同时保留互连的开放孔，或纳入无孔植入物(图1)。为了验证概念，发明人将模型蛋白质和细胞加载到3d打印的可生物降解聚己内酯和β-磷酸三钙(pcl-tcp)作为模型聚合物-陶瓷多孔支架，pcl-tcp棒状体作为模型聚合物陶瓷无孔植入物，不锈钢针作为模型金属。
5、多孔或无孔支架的表面经过三个连续步骤处理(图2a-b)，从而：
6、(1)增加亲水性/反应性/粗糙度，
7、(2)改善水凝胶粘附性，和
8、(3)刺激表面引发交联。
9、水凝胶层通过表面引发的物理交联以及后续共价交联加载于支架表面。
10、增加亲水性/反应性/粗糙度
11、使用氢氧化钠(naoh)处理和冷冻/解冻来增加pcl-tcp支架的表面亲水性/反应性。也可以使用包括等离子体或酸处理在内的其他处理方法来增加表面亲水性/反应性/粗糙度。
12、改善水凝胶粘附性
13、为了改善水凝胶粘附性，用具有共价可连接官能团的分子涂覆表面。例如，使用碳二亚胺化学法将反应性氨丙基甲基丙烯酰胺(apma)和明胶甲基丙烯酸酯(gelma)与pcl-tcp支架表面偶联(图2a-b)。胺反应性(n-羟基琥珀酰亚胺)酯二氮嗪(diazrine)(nhs-双吖丙啶(diazirine)，琥珀酰亚胺基4,4’-叠氮戊酰胺酯(azipentanoate))与不锈钢表面偶联。
14、刺激表面引发交联
15、为了刺激表面引发的物理交联，将氯化钙(cacl2)或硫酸钙(caso4)沉积于植入物表面。其他二价阳离子(例如，ca2+、mg2+、sr2+)或多价阳离子盐(例如，ti4+或al3+)也可用于表面引发的物理交联。
16、经过这三个表面处理步骤后，将支架浸入含有海藻酸、共价反应性大分子单体、引发剂和生物制剂(生物分子、药物和/或细胞)的水凝胶前体溶液中。聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(pegdma)和gelma用作共价反应性大分子单体(图2a-b)。水凝胶前体溶液中可以使用具有双键或其他共价反应性官能团(例如用于胺反应的nhs基团或用于迈克尔加成的sh基团)的其他大分子单体和交联剂。
17、当将经表面处理的支架浸入水凝胶前体溶液中时，钙离子从表面扩散到溶液中，在表面附近交联海藻酸，并在表面形成水凝胶层。然后，物理交联的水凝胶中的大分子单体在下一步中共价交联，形成坚硬的互穿网络。化学引发剂(aps/temed)和光引发剂(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦锂)分别用于制造多孔和非多孔hytec(图2a-b)。其他化学引发剂、可见光引发剂、uv引发剂或热引发剂可用于引发共价交联反应。
18、调控(tune)
19、水凝胶加载和水凝胶厚度通过改变工艺参数来调控。例如，多孔pcl-tcp支架上水凝胶层的厚度通过改变用于钙沉积的溶液中的cacl2浓度和naoh表面处理时间来调控。通过将不同部分浸入不同的溶液中，可以在空间上调控/控制构建体内涂层的厚度，从零到高值。
20、结果
21、具有不同孔隙率的3d打印的多孔pcl-tcp支架在水凝胶加载后保持多孔(图3a-)。当bmp2(作为模型蛋白)加载于hytec时，它会在离体28天内释放。由于存在厚水凝胶层，因此可以在hytec加载各种生物分子剂量。载有生物分子的hytec可以使用电子束(e-beam)方法以分割剂冻干、储存和最终灭菌(图4a-c)。活细胞可以封装在hytec的水凝胶层中(图5a-d)。此外，将水凝胶加载于不锈钢针，作为制造金属基hytec的概念证明(图6)。
22、根据应用，hytec可以是细胞性的或无细胞的，也可以是含有或不含有治疗性生物分子。其可以是新鲜的、冷冻的或冻干的。支架也可以是多孔的或无孔的，并且可由聚合物(例如聚酯)、金属、陶瓷或复合物制成。水凝胶大分子单体、凝胶化引发剂、用于钙沉积的盐和用于表面处理的材料可以根据支架表面化学性质和应用而变化。
23、应用
24、本发明的实施方式可以下列方式应用或使用，这些应用或使用方式并不限制本发明的范围。hytec用于递送包括细胞和/或生物分子在内的治疗剂以及用于再生医学应用的结构支撑和定义的几何形状。示例如下：
25、·递送骨诱导蛋白和成骨细胞以及骨传导性3d打印构建体用于治疗骨缺损。
26、·递送蛋白质和/或细胞以及3d打印的构建体用于治疗软组织缺损。
27、·递送抗生素以及3d打印的支架。
28、·递送止痛药以及3d打印的支架。
29、·递送蛋白质和药物以及金属植入物。
30、·递送血管诱导蛋白或细胞以诱导再生医学中的血管化。
31、·在癌组织中局部递送治疗剂。
32、·在糖尿病患者中局部递送β细胞以分泌胰岛素。
33、优点
34、本发明的实施方式优于现有的方法和构建体。与基于薄涂层的方法(例如逐层涂覆或用吸收剂涂覆构建体)相比，使用hytec技术可以将大剂量、更宽剂量范围或多种治疗剂或生物制剂加载于多孔(或无孔)构建体。此外，与具有薄涂层的构建体相反，细胞可以封装在hytec中。
35、hytec技术相对于多材料打印的优势如下。尽管多材料打印具有技术意义，但由于打印过程中材料之间需要多次迭代，所需制造时间长，需要专门的昂贵3d打印机，并且由于各种打印机制的性质，处理参数的选择有限。此外，同时打印聚合物/陶瓷和水凝胶会阻碍支架表面处理和界面处软硬材料整合的改善。
36、在一个实施方式中，为了减缓治疗剂的释放，生物活性植入物(例如hytec构建体)可以涂覆可吸收聚酯(例如，pcl、pla或plga)或其他可吸收聚合物(例如聚氨酯)。hytec表示混合组织工程改造的构建体，是一种生物活性植入物。图7显示了用于涂覆hytec构建体的方法的示意图。例如，将载有蛋白质的hytec在-80℃下冷冻过夜，然后在-20℃下冷冻10分钟，浸入pcl丙酮或氯仿溶液(2％-20％)，以在hytec上沉积pcl层并制备改性hytec(mhytec)。然后，将pcl涂覆的hytec在0-4℃下风干。可以改变pcl溶液的浓度和沉积的pcl层的数量，从而调控mhytec构建体的物理特性和蛋白质的释放动力学。图8显示了具有1层pcl涂层(mhytec(1l))和3层pcl涂层(mhytec(3l))的mhytec的代表性图像。虽然在14天后，无涂层的载有bsa的hytec释放了92％的封装bsa，但是使用pcl/丙酮(10％wt/v)溶液添加1层或3层保护性pcl涂层后，bsa释放率在70天后降低至92％或在91天内降低至80％(图9)。此外，在pbs中放置28天后，沉积1层或3层pcl涂层的载有bmp2的hytec构建体中释放的骨形态发生蛋白2(bmp2)蛋白的量从84％减少至62％或24％(图10)。
37、另一个示例中，本发明提供了一种形成组织工程改造构建体的方法。提供了具有表面和表面区域的支架。支架的表面经处理以增加支架的表面面积。任选地，准备支架的表面区域，以通过用共价可连接分子涂覆表面区域来促进与表面区域的化学交联。准备支架的表面区域，以通过将盐沉积于表面区域或任选地涂覆的表面区域来促进表面引发的物理交联。提供/制备水凝胶前体溶液，其含有带电聚合物、共价反应性大分子单体、引发剂和生物制剂。通过将准备/制备的支架浸入水凝胶前体溶液中，在支架表面上形成物理交联的亲水性水凝胶网络。该形成受控于表面区域的盐离子释放以及带电聚合物与释放的盐离子的物理交联。在形成过程中，物理交联的水凝胶网络捕获生物制剂并由此承载于其中。从水凝胶前体溶液移出具有物理交联的亲水性水凝胶网络的支架。共价反应性大分子单体化学交联于物理交联的亲水性水凝胶网络中以强化物理交联的亲水性水凝胶网络本身以及与支架交联。任选地(在下文所述任选地制备表面区域后)，涂覆的共价可连接分子与共价反应性大分子单体化学交联，以增加化学和物理交联的亲水性水凝胶网络对支架的粘附性。
38、在进一步的步骤中，如果需要，可以对组织工程改造构建体进行冷冻或冻干。
39、在进一步的步骤中，可以处理支架的表面区域以增加支架表面的亲水性和/或粗糙度。
40、支架可以是互连多孔结构，由此可以控制方法步骤，使得亲水性水凝胶网络物理和化学交联并与支架的互连多孔结构化学结合。然后可以通过这些受控方法步骤保留互连多孔结构的孔，以允许孔也容纳生物制剂。
41、在更进一步的步骤中，组织工程改造构建体可以涂覆一个或多个涂层。
42、在更进一步的步骤中，支架具有互连的多孔结构，并且其中涂层控制互连多孔结构的孔径。
43、在另一实施方式中，提供了一种组织工程改造构建体。构建体的特征在支架，该支架具有表面和经处理的表面区域以增加表面积/表面区域。亲水性水凝胶网络通过带电聚合物和盐离子物理交联于经处理的表面区域。物理交联的水凝胶网络捕获并由此承载生物制剂。共价反应性大分子单体化学交联于物理交联的亲水性水凝胶网络中以强化物理交联的亲水性水凝胶网络本身以及与支架交联。
44、在构建体的变体中，表面区域可以涂覆有共价可连接分子，该共价可连接分子与共价反应性大分子单体化学交联以增加化学和物理交联的亲水性水凝胶网络与支架的粘附性。构建体可以具有一个或多个涂层。支架可以是互连多孔支架，其中生物制剂也由互连多孔支架的孔承载。
45、熔融沉积模塑是一种强大的方法，可用于打印三维(3d)生物可吸收支架和医疗装置，这些支架和医疗装置具有对于生物医学应用良好控制的孔隙率、内部微结构和整体几何形状。然而，蛋白质和活细胞无法承受热挤出。在本发明的进一步表征中，工程改造了这样的混合组织工程改造构建体(hytec)，它能够通过均匀厚的水凝胶层将生物制剂(例如蛋白质和细胞)纳入3d打印的支架并同时保留互连的开放孔，或纳入无孔植入物。3d打印的可生物降解聚己内酯-β-磷酸三钙(pcl-tcp)用作模型多孔支架，pcl-tcp棒状体用作模型无孔植入物，骨形态发生蛋白-2(bmp-2)用作骨组织工程改造应用的模型蛋白。pcl-tcp构建体的表面经三个连续三步连续处理，以增加亲水性、改善水凝胶粘附性和刺激表面引发交联。通过表面引发的物理交联以及后续共价交联，水凝胶层加载于支架表面。结果表明，表面处理对支架的机械和表面性能不会产生不利影响，但会改善水凝胶对表面的粘附性。加载的水凝胶层平均厚度通过调节表面处理参数控制在100-600μm范围内。此外，孔隙率为50-80％的3d打印支架在加载水凝胶后仍然保持多孔，孔径范围为140至1100μm。使用两种细胞类型(hmsc和c3h10)进行的细胞活力和增殖测试表明，水凝胶加载对支架的生物相容性不会产生不利影响。加载了载有bmp-2的水凝胶的支架在35天内持续释放bmp-2。载有水凝胶的pcl-tcp支架的冻干和电子束灭菌对支架的机械性能不会产生不利影响，但会对释放的活性bmp-2量产生负面影响。通过使用分割剂电子束策略，灭菌de冻干hytec构建体释放的活性bmp-2量提高了2倍。厚水凝胶层使封装的活细胞能够加载于hytec构建体，7天后细胞活力超过92％。总之，本研究中介绍的hytec策略在多孔(或无孔)聚酯基3d打印的组织工程改造支架中具有巨大的前景，可以提高生物物质的载荷能力，同时保持互连的开放孔以改善组织整合和植入。
1.一种形成组织工程改造构建体的方法，其包括：
2.如权利要求1所述的方法，还包括冷冻或冻干所述组织工程改造构建体。
3.如权利要求1所述的方法，还包括进一步处理所述支架的表面区域以增加所述支架表面的亲水性、粗糙度或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述支架具有互连多孔结构，并且控制其中所述方法步骤以使所述亲水性水凝胶网络物理和化学交联并与所述支架的互连多孔结构化学结合，并且其中所述方法步骤能够保留所述互连多孔结构的孔以允许所述孔也容纳生物制剂。
5.如权利要求1所述的方法，还包括用一个或多个涂层涂覆所述组织工程改造构建体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述支架具有互连多孔结构，并且所述涂层控制所述互连多孔结构的孔径。
7.一种组织工程改造构建体，其包括：
8.如权利要求7所述的组织工程改造构建体，其中，所述表面区域涂覆有共价可连接分子，所述共价可连接分子与所述共价反应性大分子单体化学交联以增加化学和物理交联的亲水性水凝胶网络与所述支架的粘附性。
9.如权利要求7所述的组织工程改造构建体，其中，所述组织工程改造构建体具有一个或多个涂层。
10.如权利要求7所述的组织工程改造构建体，其中所述支架是互连多孔支架，并且其中所述生物制剂由互连多孔支架的孔承载。
