一种作用于SARS-Cov-2诱导的急性肺损伤的PRCP试剂盒的制作方法

一种作用于sars-cov-2诱导的急性肺损伤的prcp试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种作用于sars-cov-2诱导的急性肺损伤的prcp试剂盒。


背景技术：

2.急性肺损伤(acute lung injury，ali)是临床常见急重症，以进行性加重的呼吸困难、顽固的低氧血症为临床特征，其严重阶段可发展为成人呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ards)，ards是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高达50％。常见的致病因素主要有：感染、有害物质吸入、外伤、休克、中毒等。
3.有研究证明sars-cov-2诱导的急性肺损伤(ali)是新型冠状病毒肺炎(covid-19)患者死亡的主要病因，其机制为sars-cov-2与细胞受体血管紧张素转换酶2(ace2)结合，导致ace2缺失及其反馈性诱导血管紧张素ⅱ(angⅱ)和血管紧张素ⅰ型受体(at1r)介导的急性炎症反应。因此抑制angⅱ/at1r介导的急性炎症是治疗ali的重要靶点。然而acei/arb的使用又会增加ace2的表达，加速病毒进入细胞和复制。
4.脯氨酸羧肽酶(prcp)是一种重要的血管紧张素ii降解酶。由yang hyt等于1968年首先发现。prcp将angⅱ分解为ang1-7，反馈性调节ace/ace2 angⅱ/ang1-7动态平衡，减轻angⅱ/at1r介导的炎症反应而不增加ace2的表达。
5.现有技术中的prcp在内皮细胞炎症反应中表达上调，目前还没有作用于sars-cov-2诱导的急性肺损伤的prcp试剂盒。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种作用于sars-cov-2诱导的急性肺损伤的prcp试剂盒。本发明筛选出prcp对抑制sars-cov-2诱导ali的有效性更好的给药方式(高表达prcp的慢病毒颗粒)，并制成相应的试剂盒，提高了临床用药的有效性与安全性。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
8.第一目的，本发明提供了一种寡核苷酸，所述寡核苷酸包括检测sars-cov-2蛋白的基因的引物对。
9.作为本发明所述寡核苷酸的优选实施方式，所述寡核苷酸还包括用于检测prcp的引物对。
10.作为本发明所述寡核苷酸的优选实施方式，所述sars-cov-2蛋白的序列如seq id no:1所示。
11.作为本发明所述寡核苷酸的优选实施方式，检测sars-cov-2蛋白的基因的引物对的序列如seq id no:2～5所示。
12.作为本发明所述寡核苷酸的优选实施方式，检测prcp的引物对的序列如seq id no:6～7所示。
13.第二目的，本发明提供了一种作用于sars-cov-2诱导的急性肺损伤的prcp试剂盒，试剂盒包括上述寡核苷酸。
14.第三目的，本发明提供了一种sars-cov-2诱导ali的小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
15.s1、构建表达sars-cov-2蛋白的vero e6细胞株；
16.s2、构建表达prcp的慢病毒颗粒pez-lv105-prcp；
17.s3、分为对照组、ali 空载体组、ali模型组、ali prcp慢病毒颗粒组、ali prcp雾化给药组应用于小鼠；
18.s4、构建ali小鼠模型，并导入prcp的慢病毒颗粒。
19.作为本发明所述sars-cov-2诱导ali的小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤s3中的prcp的浓度为0.05～0.2mg/ml。
20.优选地，所述步骤s3中的prcp的浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml或0.2mg/ml。
21.本发明通过对比不同给药方式的脯氨酸羧肽酶(prcp)对sars-cov-2诱导的ali小鼠模型的疗效，筛选出有效性较好的脯氨酸羧肽酶(prcp)制成prcp试剂盒。
22.与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
23.本发明通过能表达sars-cov-2蛋白(序列如seq id no:1所示)的vero e6细胞株构建sars-cov-2诱导ali的小鼠模型，并通过尾静脉注射高表达prcp的慢病毒颗粒(pez-lv105-prcp)和雾化不同浓度的prcp蛋白进行干预，通过观察对照组与不同干预组小鼠在肺弹性变化、肺损伤评分、肺组织干湿重、肺组织病理的不同，找到prcp对抑制sars-cov-2诱导ali的有效性更好的给药方式，并制成相应的试剂盒。本发明既可指导医生实施预测用药，提高了临床用药的有效性与安全性。同时研究结果也为开发作用于开发含prcp成分的抑制sars-cov-2诱导ali的新药开发应用提供依据。
附图说明
24.图1为sasr-cov-2蛋白的pcr结果图；
25.图2为本发明构建的蛋白质表达载体的图谱；
26.图3为sasr-cov-2蛋白的鉴定结果图；
27.图4为实施例3中各组小鼠的肺组织干湿重分析结果图；
28.图5为qpcr检测prcp和ace基因mrna的表达结果图；
29.图6为qpcr检测ang和ace2基因mrna的表达结果图。
具体实施方式
30.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
31.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.sasr-cov-2、引物信息如表1和表2所示。
33.表1
34.基因名称基因id转录本id产物引物位置
buffer(含mg
2
，dntps)25μl；ddh2o 18μl；
41.②
pcr扩增程序：预变性98℃/3min；30个循环(变性98℃/10s，退火65℃/20s，延伸72℃1kb/min)，延伸72℃/5min，12℃保存。pcr结果见图1所述。
42.2)质粒提取：
①
空载菌落接种于5ml含有相应抗性的lb培养基(gl7002，捷瑞)中并置于恒温摇床中37℃、220rpm震荡摇晃过夜培养；
②
使用质粒dna微量提取试剂盒提取质粒。
43.3)酶切：
①
酶切体系：plvx-acgfp1-n1 900-1500ng；fastdigest ecor i(货号fd0274，品牌thermo fisher)1μl；fastdigest xho i(fd0694，品牌thermo fisher)1μl；10
×
universe buffer 5μl；ddh2o to 50μl；
44.②
酶切程序：37℃，10～30min。
45.4)同源重组：
①
配制同源重组体系：120ng酶切质粒、100ng pcr片段、5μl 2
×
assembly mix、补足ddh2o to 10μl；
46.②
反应体系：轻轻混合，50℃连接15分钟，反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒之后可将重组产物(蛋白质表达载体)保存于-20℃或直接用于转化。其载体的图谱如图2所示。
47.4)感受态细胞转化：
48.①
连接体系与50μl感受态细胞混合，冰上孵育30min；
②
42℃热激45s；
③
瞬间转移至冰上孵育5min；
④
将感受态细胞与1ml lb培养基混合后37℃震荡培养45min；
⑤
涂板。
49.5)鉴定：
①
挑取培养板上的单菌落(5-10个)，溶于10μl的无菌水中，取4μl作为模板进行pcr；
②
剩下的加入1ml含相应抗性的培养基中37℃摇床培养。鉴定结果见图3，鉴定引物为f：p10077和r：p10078，产物长度为1369bp。
50.6)测序：
①
pcr鉴定阳性菌落，送交测序公司，使用测序引物开展一代测序。测定sasr-cov-2蛋白序列如seq id no:1所示，重组蛋白大小为142.9kda。
51.7)无内毒素质粒提取：
52.①
取5ml过夜培养的菌液，12000
×
g离心2min收集菌体取过夜培养的菌液，去上清(尽量吸尽)。
53.②
如菌液量过大，可分多次离心收集；
54.③
加入无色溶液rb(含rnase a)250μl，振荡悬浮菌体,不应留有小的菌块；
55.④
加入蓝色溶液lb 250μl，温和地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)；
56.⑤
加入黄色溶液nb 350μl，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟；
57.⑥
12000xg离心5分钟，小心吸取上清加入高心柱中。12000xg离心1分钟，弃流出液(如上清体积大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。)；
58.⑦
加入250μl溶液tb，室温静置10分钟，12000xg离心1分钟，弃流出液；
59.⑧
加入650μl溶液wb，12000xg离心1分钟，弃流出液；
60.⑨
12000xg离心1-2分钟，彻底去除残留的wb；
61.⑩
将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50-70μl eb或去离子水(ph》7.0)室温静置1分钟。(eb或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)。10000g离心1分
钟，洗脱dna，洗脱出的dna于-20℃保存。
62.实验结果：
63.经过pcr及鉴定步骤，测得pcr条带大小与目的扩增片段相同，代表该克隆为载体重组成功克隆。
64.实施例2、核酸转染、扩大培养
65.种板：转染前一天，将vero e6细胞株接种细胞培养板，控制第二天细胞汇合度约为70-80％；
66.温度平衡：将hieff transtm、无内毒素质粒、无血清培养基平衡至15-25℃；
67.配置转染体系：用50μl无血清培养基稀释2μg蛋白质表达载体，用同样的50μl培养基稀释6μl hieff transtm试剂；静置5min，轻轻涡旋载体溶液，并逐滴添加稀释的hieff transtm试剂，充分混匀后，室温精制10-25min以形成dna-hieff transtm复合物；
68.转染：把培养板中的旧培养基换成1ml新鲜基础培养基，并将复合物逐滴加入孔中，边加边摇晃，37℃，5％co2培养基继续培养48h，收集细胞(表达sasr-cov-2蛋白的vero e6细胞株)。
69.实施例3、构建sasr-cov-2诱导ali的小鼠模型
70.组别设置：84只3月龄balb/c雄性小鼠，随机分为对照组、ali 空载体组(sasr-cov-2蛋白诱导ali模型 空载体)、ali模型组(sasr-cov-2蛋白诱导ali模型)、ali prcp慢病毒颗粒组(ali 过表达组)、ali 低剂量雾化组(sasr-cov-2蛋白诱导ali模型 5μg/kg prcp蛋白)、ali 中剂量雾化组(sasr-cov-2蛋白诱导ali模型 10μg/kg prcp蛋白)、ali 高剂量雾化组(sasr-cov-2蛋白诱导ali模型 20μg/kg prcp蛋白)。12只小鼠/每组。
71.实验步骤：
72.1、注射：模型构建前一天，ali prcp组(低、中、高剂量)通过尾静脉注射125μl的pez-lv105-prcp病毒颗粒，ali 空载组通过尾静脉注射125μl的空载体，其他组分别通过尾静脉注射125μl的生理盐水。
73.2、模型构建：小鼠麻醉后，气管切开，在腹膜内注射5.5nmol/kg sasr-cov-2蛋白，随后用盐酸溶液(ph＝1.5，2ml/kg)进行气管内灌输，1h和2h后再次腹膜内注射5.5nmol/kg sasr-cov-2蛋白。
74.3、雾化给药：1)取10mg prcp蛋白，溶解于1ml去离子水(30℃预热)，配制成10mg/ml原液，备用；2)用30℃预热的去离子水稀释prcp原液，分别稀释成0.05mg/ml(i号溶液)、0.1mg/ml(ii号溶液)、0.2mg/ml(iii号溶液)；3)使用小鼠雾化专用雾化给药仪进行雾化给药：ali 低、中、高剂量雾化组，根据体重分别给予相应的i、ii、iii溶液(100ml/kg体重)，其余组则根据体重给予去离子水(100ml/kg体重)。
75.处死小鼠，测定小鼠肺组织干湿重。
76.肺组织干湿重分析：1)小鼠右侧肺组织用滤纸沾干表面的水分，准确称重并记录(湿重)；2)60℃恒温烤箱中烘烤24h至恒重，准确称重并记录(湿重)；3)计算w/d，评估肺组织的水肿程度(数值越高则肺组织水肿越严重)。
77.结果显示，参考图4，与对照组(不利用sasr-cov-2诱导ali)小鼠相比，ali模型组、ali 空载体组、ali 低剂量雾化组和ali 中剂量雾化组的小鼠的肺湿/干重比显著增加，ali prcp慢病毒颗粒组和ali 高剂量雾化组无显著差异。ali prcp慢病毒颗粒组能显著改
善肺组织水肿；雾化给药则呈现出剂量依赖关系，药物浓度越高，效果越显著(与对照组相比，1)t检验:p＜0.001,差异性极显著(***)；0.001＜p＜0.01,差异性显著(**)；0.01＜p＜0.05,差异性显著(*)；0.05＜p,差异性不显著(ns).)。
78.4、逆转录
79.样本前处理：将经过各组处理的小鼠肺组织样本于研钵中液氮研磨成粉末；转移至1.5ml离心管中，按照0.1g组织加入1ml magzol。
80.总rna提取：
①
将1.5ml离心管剧烈震荡10次，室温孵育5min；
②
按0.2ml氯仿/1ml magzol加入氯仿并充分震荡20s；
③
12000g，4℃离心10min；
④
吸取上清(0.5ml上清/1ml magzol)转移至新离心管中，切勿吸到中间层；
⑤
按等倍体积加入异丙醇，充分混匀；
⑥
冰上静置15-20min；
⑦
12000g，4℃离心10min，小心弃去上清；
⑧
加入1ml预冷的75％乙醇(无酶水配制)，7500g，4℃离心5min，小心弃去上清；
⑨
打开ep管盖，室温自然挥发乙醇10min；
⑩
加入30-50μl depc溶液室温溶解rna 5min。
81.质量检测：
①
取2μl rna样品检测rna od260、od280，根据od260/od280计算总rna浓度及杂质污染程度；
②
剩余rna样品置于-80℃保存。
82.cdna合成：
①
逆转录体系：4
×
gdna wiper mix:4μl、总rna：0.5-1μl，加rnase free ddh2o补齐至16μl，42℃2min；
②
加5
×
hiscript ii qrt supermix ii：4μl，37℃15min、85℃5s、12℃终止；
③‑
20℃保存cdna待用。
83.3、qpcr
84.qpcr：
①
反应体系配制：chamq universal sybr qpcr(2
×
)：10μl、forward primer：1μl、reverse primer：1μl、cdna模板：2μl、ddh2o补齐至20μl；
②
95℃预变性5min；
③
40个循环：95℃变性15s、60℃退火20s、72℃延伸20s；采集荧光信号；
④
70-95℃变性溶解曲线。
85.数据分析：
86.①△
ct公式为：
△
ct＝ct(目的基因)-ct(内参基因，gapdh)；
②△△
ct公式为：
△△
ct＝
△
ct(目标样本)
‑△
ct(对照样本)；
③
2e(
‑△△
ct)：以2为底，以
‑△△
ct为幂值，结果呈现差异倍数。
87.qpcr分别检测prcp、angii、ace、ace2基因mrna的表达结果图5-6所示(t检验:p＜0.001，差异性极显著(***)；0.001＜p＜0.01，差异性显著(**)；0.01＜p＜0.05，差异性显著(*)；0.05＜p，差异性不显著)。
88.相对于对照组，基因prcp、ace、ang在ali模型组、ali prcp慢病毒颗粒组、ali 空载体组、ali 低剂量雾化组、ali 中剂量雾化组和ali 高剂量雾化组中表达上调；基因ace2在ali模型组、ali prcp慢病毒颗粒组、ali 空载体组、ali 低剂量雾化组、ali 中剂量雾化组和ali 高剂量雾化组中表达下调。
89.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。