本发明属于木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体涉及一种鉴别润楠属近缘种的特异性引物及其鉴别方法和应用。
背景技术：
1、润楠属(machilus nees)植物广泛分布于亚洲东部、南部地区，是热带和亚热带常绿阔叶林的常见树种，其树干可作木材，树皮和叶可作褐色染料、熏香调和剂、饮用水纯化剂，种子油可作润滑剂，全株可提芳香油，具有重要的经济和观赏价值。其中，江南四大名木——楠木的原材料就包括楠属(phoebe)和润楠属的许多物种。根据国际自然保护联盟(international union for con servation of nature，iucn)和中国生物多样性红色名录(高等植物卷)，润楠属多个物种被评定为不同程度的濒危级别，如被列为近危nearthreatened(nt)的枇杷叶润楠(m.bonii)、浙江润楠(m.chekiangensis)、川黔润楠(m.chuanchienensis)、细毛润楠(m.tenuipilis)，被列为易危vulne ralbe(vu)的察隅润楠(m.chayuensis)、暗叶润楠(m.melanophylla)、小花润楠(m.minutiflora)，以及被列为濒危endangered(en)的润楠(m.nanmu)等。此外，该属的濒危模式种润楠的野生群体局限分布于我国四川和云南东北部，生境明显退化，成熟个体数量少于1,000个，已被国务院2021年批准的《国家重点保护野生植物名录》列为国家二级保护植物。然而，随着人民生活质量提升，对高品质木材的需求进一步助长了非法采挖、砍伐濒危润楠的不良风气。对市场流通的相关制品的原材料进行准确鉴定是保护濒危物种、维护生物多样性的基础，因此，整合一套切实可行、高效精确的润楠属物种界定标准是落实应用的重要保障。
2、经典的形态分类法根据花被片是否被毛、果实形状或大小等对润楠属物种进行界定，随着显微技术的发展，花粉特征、叶表皮形态、木材结构等也被纳入辅助分类的证据。然而，润楠属起源时间较晚，物种亲缘关系较近，这些特征彼此间可能存在种内变异、种间交叉，并在实际运用过程中受到人为主观判断的影响。此外，在市场流通的相关制品中，多数已经过精细加工，几乎难以辨别原材料的形态鉴别特征，遑论集齐花、果等不同时期的组织样品综合鉴定。近几十年来，随着分子生物学技术和测序技术的快速发展，分子标记被广泛应用于物种界定和系统演化的研究中，有效地规避了形态学物种鉴定方法的弊端。前人研究已确立润楠属的独立分类地位，但在属下物种界定上仍存在争议。已有的通用标记(如叶绿体基因组的编码基因rbcl，matk等)在这类进化关系复杂的类群中表现欠佳，为进一步提升润楠属物种界定的精确度，基于广泛取样的特异性分子标记开发势在必行。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是：针对传统形态学方法和显微技术无法精准区分润楠属物种的问题，本发明旨在筛选润楠属不同物种的特异性序列，开发高分辨率的属内通用引物，并详细阐明该分子标记在润楠属物种实际鉴定过程中的应用细则。
2、本发明提供一种可用于润楠属不同物种pcr鉴定的通用引物pa-pj，所用润楠属物种共计24个，包括：m.balansae、m.bonii、m.calcicola、m.chay uensis、m.chekiangensis、m.chuanchienensis、m.faberi、m.gamblei、m.grijsii、m.leptophylla、m.lichuanensis、m.melanophylla、m.minu tiflora、m.nanmu、m.oreophila、m.pauhoi、m.rehderi、m.robusta、m.salicina、m.tenuipilis、m.thunbergii、m.velutina、m.versicolora和m.yunnanensis。
3、一种鉴别润楠属不同近缘物种的特异引物pa-pj，所述特异引物pa-pj的扩增序列如下：
4、pa-pj primer-f：5'-caattgtccgaaatgaatttctag-3'，
5、pa-pj primer-r：5'-tccggctcatccgattac-3'。
6、一种润楠属不同近缘物种的鉴别方法，包括如下步骤：
7、s21、叶片样本的预处理；
8、s22、提取经步骤s21处理后的叶片样本中的dna；
9、s23、以步骤s22提取到的dna为模板，对pa-pj序列进行pcr扩增；
10、s24、将步骤s23得到的pcr扩增产物进行测序，得到特异引物pa-pj的扩增序列，并对其进行分析；其中，所述扩增序列如下：
11、pa-pj primer-f：5'-caattgtccgaaatgaatttctag-3'，
12、pa-pj primer-r：5'-tccggctcatccgattac-3'；
13、s25、以步骤s24所得pa-pj的扩增序列结果，通过数据库比对鉴别不同近缘物种。
14、作为本发明的优选方案，所述预处理是指洗涤叶片、擦拭叶片表面，并使用研磨仪打碎至粉末状。
15、作为本发明的优选方案，所述dna的提取是使用dneasy plant mini kit(qiagen，hilden，germany)试剂盒完成的。
16、作为本发明的优选方案，所述pcr扩增的反应体系为ddh2o 8.5μl，mix12.5μl，双端引物各1μl、模板dna 2μl；pcr扩增的反应条件为95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
17、作为本发明的优选方案，所述数据库为国际生物技术信息中心(national centerfor biotechnology information，ncbi)的核酸在线比对工具(nucle otide blast)，链接如下：
18、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome。
19、一种特异引物pa-pj在鉴别润楠属不同近缘物种中的应用，所述特异引物pa-pj的扩增序列如下：
20、pa-pj primer-f：5'-caattgtccgaaatgaatttctag-3'，
21、pa-pj primer-r：5'-tccggctcatccgattac-3'。
22、作为本发明的优选方案，所述特异引物pa-pj的筛选方法，包括如下步骤：
23、s81、从ncbi网站nucleotide数据库搜索并下载润楠属叶绿体基因组数据，共计45条序列，涵盖22个物种；
24、s82、取润楠属不同近缘物种的叶片组织并使用硅胶干燥、常温保存；
25、s83、使用试剂盒对所述叶片组织进行dna抽提，建立cdna文库，开展基因组浅层测序(genome skimming)，获得下机后原始数据；
26、s84、对双端测序原始数据进行短序列剔除过滤，使用getorganelle软件对过滤后数据进行组装，获得4条叶绿体基因组序列；
27、s85、使用geneious软件，基于mafft算法对下载的45条序列和自测组装的4条序列进行比对，剔除可信度较低的首尾数据，得到整齐的比对矩阵；
28、s86、使用dnasp软件，基于滑窗口法对所述比对矩阵进行核苷酸多态性(π)计算，窗口大小设为500bp，步长100bp；
29、s87、筛选π值top1％的区间人为复核，筛选种间特异性较高的区域为候选dna条形码区域。
30、与现有技术相比，本发明具有以下优点：
31、1、本发明摆脱了传统形态学方法对样品外观特征完整性的依赖，只需少量组织样本即可满足检测需求，实用性更高；
32、2、本发明基于扩增的特异性序列，将鉴定的分类等级精确到“种”，大大提升了属下近缘种之间的分辨率；
33、3、本发明所用引物通用性高，仅1对引物即可分辨润楠属下24个物种，实际操作过程中更高效、便捷；
34、4、本发明对仪器设备、试剂耗材和人员技术方面的要求不高，普通pcr实验室均可满足，大大减少了人力、物力、财力的投入；
35、综上，本发明使用一种润楠属通用的dna条形码，实现24个同属近缘种的准确鉴别，在摆脱样品限制、优化取样方案的基础上，大大提升了该属植物物种鉴定的广度和深度，满足各相关部门对润楠属物种快速筛查和鉴定的要求，为保护濒危种质资源、维护生态多样性、整顿贸易市场风气提供了科学技术支持，具有较高的实用价值和社会意义。
1.一种鉴别润楠属不同近缘物种的特异引物pa-pj，其特征在于，所述特异引物pa-pj的扩增序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种鉴别润楠属不同近缘物种的特异引物pa-pj，其特征在于，所述特异引物pa-pj的筛选方法，包括如下步骤：
3.一种润楠属不同近缘物种的鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种润楠属不同近缘物种的鉴别方法，其特征在于，所述预处理是指洗涤叶片、擦拭叶片表面，并使用研磨仪打碎至粉末状。
5.根据权利要求3所述的一种润楠属不同近缘物种的鉴别方法，其特征在于，所述dna的提取是使用dneasy plant mini kit(qiagen，hi lden，germ any)试剂盒完成的。
6.根据权利要求3所述的一种润楠属不同近缘物种的鉴别方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为ddh2o 8.5μl，mix 12.5μl，双端引物各1μl、模板dna 2μl；pcr扩增的反应条件为95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。
7.一种特异引物pa-pj在鉴别润楠属不同近缘物种中的应用，其特征在于，所述特异引物pa-pj的扩增序列如下：
