本发明属于分子育种，具体涉及脂磷酸磷酸酶lppα3基因在提高油菜种子含油量中的应用。
背景技术：
1、油菜是全球第二大油料作物，不仅是食用植物油的原料，也是重要的饲用蛋白来源。同时，菜籽油是重要的可再生能源物质及工业原料。此外，油菜兼具菜、花、蜜、茶、肥等多维度用途，其经济效益贯穿于全产业链，具有显著的社会、生态和经济效益。经过数十年的研究和品种选育，我国油菜油脂品质得到了显著的提高，特别是双低油菜品种的培育，但单位产油量依然与其他菜籽油生产大国存在较大差距。我国人多地少，耕地资源相对有限。目前，我国食用油自给率一直处于低位，仅占需求总量的32％左右，68％依赖于进口。因此，在不与主粮争地的条件下，提高油菜单位面积产油量，对提高国产植物油自给率极为重要。油菜单位面积产油量是由单位面积的油菜籽产量和种子含油量共同决定，并且含油量的提高对提高产油量贡献更大，据统计，种子含油量每提高1％相当于提高种子产量2.3％-2.5％。因此，挖掘调控种子含油量的关键性基因，提高油菜种子含油量是解决我国国产食用植物油自给率的重要举措之一。
2、油料植物种子含油量主要取决于储存脂成分三酰甘油(triacylglycerol,tag)高低。研究表明植物tag合成存在不同的途径，且不同途径之间存在复杂的互作和协同关系。复杂的tag合成途径包含了两条主要途径：脂酰基-coa依赖的kennedy途径和磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,pc)脂酰基依赖途径。在脂酰基-coa依赖的kennedy途径中，二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,dgat)以脂酰基-coa作为酰基供体，对二酰甘油(diacylglycerol,dag)sn-3羟基进行脂酰基化生成tag；在pc脂酰基依赖途径中，磷脂：二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase,pdat)将pc的酰基转移到dag的sn-3羟基上形成tag。此外，植物中也存在pdct催化pc与dag的相互转化，并进行酰基链的再编辑，从而影响tag的合成。由此可见，tag合成受多种代谢途径调控，种子油脂积累的分子机制相当复杂，提高种子含油量的育种更具挑战性。鉴于此，我们需要挖掘种子油脂积累的关键节点，从中找出具有提高种子含油量的重要基因。
3、上述各种tag合成的不同途径均需要dag作为直接底物，而充足的dag供给对tag合成具有重要作用。脂磷酸磷酸酶(lipid phosphate phosphatase,lpp)可催化磷脂酸(phosphatidic acid,pa)的去磷酸化而产生dag。植物lpp属于多基因家族，研究发现拟南芥含有9个lpp基因，包括lppα1、lppα2、lppα3、lppα4、lppβ、lppγ、lppδ、lppε1和lppε2。目前，植物中多数lpp成员的功能尚未清楚，仅有少数lpp的生物学功能得到鉴定，例如，研究发现拟南芥lppα2缺失突变体pa含量明显积累，导致种子对脱落酸(aba)信号更加敏感；拟南芥lppα2和lppε1存在功能冗余并共同参与花粉发育和种子萌发过程；拟南芥lppγ和lppε1也具有功能冗余并协同参与真核途径的糖脂合成,。目前，已报道的lpps主要通过介导pa信号参与渗透胁迫反应或参与磷脂代谢调控生长发育，其缺失对种子含油量没有明显影响。lpp催化pa去磷酸化而产生dag，为tag合成提供直接底物，有关lpp是否参与种子油脂合成需要进一步探索。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供了油菜脂磷酸磷酸酶lppα3基因在提高种子含油量的应用。本发明研究发现油菜bnalppα3在油脂积累高峰期的种胚油中高度表达，且该酶定位于油脂合成的内质网中。进一步通过克隆甘蓝型油菜bnalppα3全长cds以及在油菜中超表达bnalppα3可显著提高种子含油量，其含油量比对照(野生型)增加5.4％～6.9％,并且油酸组分显著提高，对提高种子含油量和油脂品质具有双重效应。并且，甘蓝型油菜bnalppα3的缺失突变导致种子含油量和油酸组分显著低于对照野生型，进一步明确bnalppα3对油菜种子油脂合成具有正向积极的效应。这些结果表明通过分子遗传操作改变bnalppα3表达量可有效调控种子油脂积累，为提高油料作物种子含油量和油脂品质提供了关键新基因。同时，本发明创建了含不同表达量的bnalppα3植物材料，包括bnalppα3超表达和缺失突变体，特别是超表达植物材料可用于作物遗传改良，为培育高含油量油菜提供新种质材料。
2、本发明还阐明了bnalppα3编码一种具有活性的脂磷酸磷酸酶，可催化pa产生dag，且该酶定位于油脂合成的内质网中。通过改变油菜体内的bnalppα3的表达可显著影响种胚的脂质代谢，其缺失突变导致种胚dag和pc含量显著降低，进而使种子含油量和油酸组分显著下降。此外，本发明还发现油菜bnalppα3可提高种胚tag合成酶bnadgat和bnapdat基因表达量。这些结果阐明了bnalppa3促进磷脂转化为存储脂tag的分子、遗传、生化、细胞、转录、代谢特征，奠定了油料作物高油育种的理论基础和依据。
3、本发明提供了脂磷酸磷酸酶lppα3基因、含有其的表达盒、含有其的载体、含有其的微生物在调控植物种子含油量和/或油脂品质、制备调控植物种子含油量和/或油脂品质的产品中的应用，所述基因所编码的蛋白质序列如seq id no.5-8任一所示。
4、进一步地，所述植物包括甘蓝型油菜，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1-4任一所示。
5、进一步地，通过调控油酸c18:1含量进而影响油脂品质。
6、本发明还提供了一种调控植物种子含油量和/或油脂品质的方法，将过表达或敲除bnalppα3基因的载体导入植物体内形成转基因植物，所述bnalppα3基因的氨基酸序列如seq id no:5-8任一所示。
7、进一步地，所述植物包括甘蓝型油菜，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1-4任一所示。
8、进一步地，所述转基因植物表现出如下b1)或b2)表型：
9、b1)转基因植物种子含油量高于受体植物；
10、b2)转基因植物种子油酸c18:1含量高于受体植物。
11、本发明还提供了一种植物育种或辅助植物育种的方法，通过筛选高表达lppα3基因的个体进而培育植物新品种，所述新品种表现出种子含油量显著提高和/或种子油酸c18:1含量显著提高。
12、有益效果：
13、1.本发明发现bnalppα3在油菜种胚中高度表达，其缺失导致油菜种子含油量明显低于对照野生型，而超表达bnalppα3可显著提高种子含油量。
14、2.本发明发现bnalppα3缺失突变导致油菜种子油脂中的油酸(18:1)组分显著降低，而超表达bnalppα3可显著提高油酸含油量，改善油脂品质。
15、3.本发明发现bnalppα3编码有活性的脂磷酸磷酸酶,该酶定位于内质网，可催化磷脂酸产生二酰甘油,其活性不依赖于镁离子，但受到n-乙基马来酰亚胺(nem)的轻微抑制，且在中性偏酸的条件下活性最高。并且bnalppα3缺失突变体种胚的脂磷酸磷酸酶催化pa的活性明显低于野生型，而bnalppα3超表达的活性显著高于野生型。
16、4.本发明发现bnalppα3缺失导致发育种胚中的dag和pc含量明显低于野生型，表明bnalppα3促进dag和pc的生成，继而为tag合成提供直接底物，从而促进种子油脂合成。
17、5.本发明发现bnalppα3的缺失突变导致bnadgat1和bnadgat2的下调表达，而超表达bnalppα3则促进bnadgat1和bnapdat的表达，表明bnalppα3还可促进油脂合成通路相关基因的表达，进一步增强种胚油脂合成。
18、综上所述，本发明为提高油料作物种子含油量和油脂品质提供了关键新基因，并创建了bnalppα3超表达植物材料用于作物遗传改良，为培育高含油量油菜提供新种质材料。此外，本发明还阐明了bnalppa3促进磷脂转化为存储脂tag的分子、遗传、生化、细胞、转录、代谢特征，奠定了油料作物高油育种的理论基础和依据。
1.脂磷酸磷酸酶lppα3基因、含有其的表达盒、含有其的载体、含有其的微生物在调控植物种子含油量和/或油脂品质、制备调控植物种子含油量和/或油脂品质的产品中的应用，其特征在于，所述基因所编码的蛋白质序列如seq id no.5-8任一所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括甘蓝型油菜，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1-4任一所示。
3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，通过调控油酸c18:1含量进而影响油脂品质。
4.一种调控植物种子含油量和/或油脂品质的方法，其特征在于，将过表达或敲除bnalppα3基因的载体导入植物体内形成转基因植物，所述bnalppα3基因的氨基酸序列如seq id no:5-8任一所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物包括甘蓝型油菜，所述基因的核苷酸序列如seq id no:1-4任一所示。
6.根据权利要求4-5任一所述的方法，其特征在于，所述转基因植物表现出如下b1)或b2)表型：
7.一种植物育种或辅助植物育种的方法，其特征在于，通过筛选高表达lppα3基因的个体进而培育植物新品种，所述新品种表现出种子含油量显著提高和/或种子油酸c18:1含量显著提高。
