与饭豆抗豆象QTL位点紧密连锁的分子标记及其在小豆抗豆象分子标记辅助育种中的应用

与饭豆抗豆象qtl位点紧密连锁的分子标记及其在小豆抗豆象分子标记辅助育种中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种饭豆抗豆象qtl位点，同时还涉及与该饭豆抗豆象qtl位点连锁的分子标记，以及该qtl位点及分子标记在小豆抗豆象分子标记辅助育种中的应用。本发明属于分子标记辅助育种技术领域。


背景技术：

2.豆象是危害小豆、绿豆、豇豆等食用豆类作物的主要仓储害虫。受豆象危害后，食用豆表面出现孔洞，重量降低，营养丧失，质量严重下降。目前，生产上防治豆象危害的方法主要为磷化铝熏蒸法。这不仅增加了食用豆生产的成本，而且磷化铝如果使用不当，容易造成环境污染、导致人畜中毒。防治豆象危害最为经济且环保的方法是培育抗豆象食用豆品种。
3.小豆中缺少抗豆象资源。到目前为止，已有的报道中还未从小豆或其野生种材料中发现抗豆象材料。现有的小豆抗豆象研究是基于小豆的近缘野生种vigna nepalensis。somta等利用vigna nepalensis与小豆进行杂交，构建遗传分离群体，对其抗豆象基因位点进行了定位，然而在他们发现的抗豆象qtl位点中，大部分位点与籽粒大小紧密连锁，后代材料在表现抗豆象的同时往往籽粒较小，这就不利于用其培育抗豆象且籽粒较大、商品性较好的小豆品种。
4.大部分饭豆资源对豆象有抗性，且作为栽培种，其籽粒较大，在育种应用中可以较少的引入不利性状。前期，我们已经通过幼胚拯救的手段实现了小豆与饭豆间的远缘杂交。这就为培育抗豆象小豆种质或品种提供了条件。在回交过程中我们发现，若不对抗豆象表型进行紧密追踪，回交后代材料中很容易丢失抗豆象特性。因此需要对抗豆象基因进行定位，以进行分子标记辅助选择，实现对抗豆象表型的标记跟踪。
5.本发明利用河北省农林科学院粮油作物研究所保存的抗豆象饭豆资源饭豆f021，通过利用远缘杂交和幼胚拯救构建了遗传研究群体，结合室内抗豆象鉴定，利用多态性ssr标记构建遗传连锁图谱定位饭豆抗豆象基因，为今后小豆和饭豆抗豆象分子标记辅助育种及抗豆象基因精细定位奠定基础。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种与抗豆象相关的qtl位点以及与该qtl位点紧密连锁的分子标记及其在小豆抗豆象育种中的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
8.本发明筛选饭豆抗豆象qtl位点及ssr分子标记的方法如下：
9.s1:以抗豆象饭豆f021作母本，以感豆象亲本白红2号作父本进行杂交，经过幼胚拯救，获得f1；f1连续自交，采用单粒传法构建f8代ril群体，该ril群体包括178个单株材料；
10.s2:ril群体每个株系分别接种绿豆象成虫，即为2个处理，每个处理设置3次重复；
55℃复性50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；取出pcr产物4℃保存。
22.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
23.本发明通过“饭豆f021
×
白红2号”杂交，结合幼胚拯救，形成稳定的ril作图群体，利用经筛选出来的264个多态性标记，构建了一个包含11个连锁群、总长268.2cm、密度适中的遗传连锁图谱，借助该遗传连图谱定位了一个饭豆抗豆象qtl位点(lod值大于4)，命名为umbr1，位于第2连锁群achr7-43～achr7-71标记区间内，标记间的遗传距离为0.7cm，表型变异解释率为12.3％、加性效应为-0.165。同时，还筛选得到与该qtl位点连锁的两个ssr分子标记为achr7-43和achr7-71，通过利用这2个ssr分子标记检测该qtl位点，在苗期就可以进行抗豆象材料的筛选，能够大大提高筛选效率，节约生产成本，加快育种进程。
附图说明
24.图1为本发明umbr1位点在第2连锁群的位置及抗豆象qtl定位图；
25.图2为标记achr7-43和achr7-71在饭豆与小豆远缘杂交后代株系中的扩增结果；
“♀”
指母本饭豆f021，指父本白红2号；1-28分别代表28个后代株系。
具体实施方式
26.为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
27.实施例1饭豆抗豆象qtl位点及ssr分子标记的筛选
28.1、ril群体构建
29.抗豆象材料饭豆f021由河北省农林科学院粮油作物研究所种质库保存。感豆象材料白红2号为吉林白城市农科院育成品种，饭豆f021作母本杂交，进行幼胚拯救，获得f1。f1连续自交，采用单粒传法构建f8代ril群体，该群体包括178个株系，用于构建遗传连锁图谱和抗豆象qtl定位研究。
30.2、亲本及ril群体材料抗豆象鉴定
31.供试豆象：绿豆象由河北省粮油作物研究所食用豆研究室繁殖保存。
32.从ril群体每个株系随机选取60粒正常籽粒，分成3份，每份20粒，形成3套抗豆象鉴定材料，接种绿豆象成虫，即设3次重复。以抗豆象亲本饭豆f021和感豆象亲本白红2号作为对照。分别置于大塑料箱中，养虫室温度30(
±
1)℃，湿度55％-65％。感豆象亲本全部籽粒被蛀食开始调查(约30-50d)，调查记录鉴定材料的被害粒数，计算平均被害率。
33.结果表明：ril群体各株系被害率变异较大，呈连续性分布，符合数量性状遗传的频率分布特点；父本饭豆f021含有减少种子被害率的基因。
34.3、dna提取
35.采集两亲本及ril群体每个株系幼嫩的三出复叶置于2.0ml离心管内，-80℃保存，以备提取dna。
36.采用ctab法提取叶片总dna，具体步骤如下：
37.(1)采摘幼嫩的三出复叶作为提取dna的材料，用蒸馏水洗净，用滤纸吸干。
38.(2)取新鲜的嫩叶0.5g左右置于研钵中，加入液氮，迅速研磨至发白粉末状后立即装入2ml离心管。
39.(3)加入已预热的2
×
ctab提取缓冲液700μl浸透粉末并倒转离心管，使粉末充分散开，于65℃水浴60min，其间轻柔混合2-3次。
40.(4)取出离心管，冷却至室温，加入700μl的氯仿/异戊醇(24/1)，轻缓颠倒混匀，静置10min。
41.(5)13000rpm离心10min。
42.(6)取上清600μl转移至新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，轻缓颠倒混匀，室温放置10min。
43.(7)13000rpm离心10min，取上清400μl转移至新离心管中，加等体积已预冷的异丙醇，保存于-20℃，静置20min。
44.(8)13000rpm离心10min，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清，用600μl 70％的乙醇洗涤沉淀2次，室温下微干。加入300μl去离子水溶解沉淀。
45.(9)加入1μl rnase(10mg/ml)置于37℃水浴60min，每个离心管加300μl去离子水，加入等体积的氯仿/异戊醇抽提2次。
46.(10)吸取上清400μl转入新离心管，加入上清体积1/10的3mol/lnaac溶液，2.5倍体积的预冷无水乙醇沉淀dna，置于-20℃，20min左右，12000rpm离心10min，弃上清。
47.(11)用600μl 70％的乙醇洗涤沉淀2次，通风干燥或者自然干燥。
48.(12)加入30μl te缓冲液溶解dna，4℃保存备用。(-20℃长期保存)
49.(13)使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测dna质量。利用超微量核酸蛋白检测仪(nanodrop nd-2000，美国)检测dna浓度，并将dna稀释到10ng/μl，以作为pcr扩增的模板。
50.4、多态性标记筛选
51.(1)筛选方法为：以亲本dna为模板，利用3072个不同来源ssr标记，进行pcr扩增，以相应的pcr扩增产物的电泳结果为依据，筛选用于构建饭豆与小豆远缘杂交遗传连锁图谱的多态性的ssr标记。
52.(2)pcr扩增反应体系：pcr反应体系为10μl：模板dna1μl，taq mix5μl，上引物0.5μl，下引物0.5μl，ddh2o 3μl。
53.(3)pcr扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性50s，50-55℃复性50s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；取出pcr产物4℃保存。
54.(4)聚丙烯凝胶电泳分析：电泳上槽液和下槽液均使用0.5
×
tbe缓冲液。电压为280v，电泳时间参照电泳1-1.5h，根据扩增产物大小进行调整。停止电泳后，采用naoh快速银染法进行染色显影。显影结束后，拍照，读带。
55.(5)根据电泳结果，筛选出在“饭豆f021”和“白红2号”之间扩增重复稳定，条带清晰，具有多态性的引物。
56.统计利用3072个不同来源ssr标记筛选亲本间多态性标记(见表1)。经过pcr扩增结果显示，筛选到264个多态性标记。以这264个多态性标记构建饭豆与小豆远缘杂交遗传连锁图谱。
57.表1多态性ssr分子标记分析
[0058][0059]
5、遗传连锁图谱构建
[0060]
利用264个亲本间多态性ssr标记、f8代ril群体各株系的dna，通过pcr扩增与条带分析对ril群体各株系进行基因分型分析。读板时，母本带型记作“0”，父本带型记作“2”，杂合带型记作“1”，空缺或其它带型记作
“‑
1”，并利用joinmap 4.0作图软件构建饭豆与小豆远缘杂交遗传连锁图谱构建。
[0061]
利用joinmap 4.0对264个多态性标记和178个ril株系基因型分型结果进行遗传连锁分析。264个多态性标记可分成11个连锁群，与饭豆及小豆的单倍体染色体数目(2n＝22)相一致。
[0062]
通过前述方法，最终构建了一张包含264个标记、11个连锁群的遗传连锁图谱(见表2)，图谱总长为268.2cm，标记间平均遗传距离为1.5cm。
[0063]
表2图谱中连锁群标记及其分布
[0064][0065]
6、饭豆抗豆象qtl定位分析
[0066]
利用mapqtl6复合区间作图法(im)，结合178个ril群体株系抗豆象表型鉴定结果和分子标记分型结果进行qtl定位分析，检测到一个与抗豆象相关的qtl位点，命名为umbr1(见图1)，位于第2连锁群achr7-43～achr7-71的标记区间内、遗传距离为0.7cm，lod值为4.72，对应于小豆7号染色体，该qtl位点可解释12.3％的表型变异(即pve)，加性效应为-0.165，来自父本饭豆f021的基因型具有降低种子被害率的效应(表3)。同时，还筛选得到与umbr1位点连锁的两个ssr分子标记为achr7-43和achr7-43。
[0067]
其中所述的ssr分子标记achr7-43为achr7-43f引物和achr7-43r引物扩增的片
段，所述的ssr分子标记achr7-71为achr7-71f引物和achr7-71r引物扩增的片段，achr7-43f引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，achr7-43r引物的核苷酸序列如seq id no：2所示；achr7-71f引物的核苷酸序列如seq id no：3所示，achr7-71r引物的核苷酸序列如seq id no：4所示。
[0068]
achr7-43f:tgtatgctatccatatccgtc(seq id no：1)，
[0069]
achr7-43r:caccggagatgttaatgaat(seq id no：2)；
[0070]
achr7-71f:gacagaagaagctcactcaaa(seq id no：3)，
[0071]
achr7-71r:cggatgggttagagttacaa(seq id no：4)。
[0072]
利用与umbr1位点连锁的2个ssr分子标记为achr7-43和achr7-71对ril群体1-28号株系进行电泳分析，其中第13、23，26号表现父本白红2号的基因型或杂合基因型(见图2)，与抗豆象鉴定结果一致，这3个株系表现为完全感豆象，抗虫率均为0，其余在这2个位点表现母本饭豆f021基因型或表现杂合的株系抗虫率56.5-87.1％(表3)。
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表3饭豆与小豆远缘杂交后代抗豆象鉴定结果
[0074]