本发明涉及蛋白质分离，具体为一种初乳碱性蛋白的制备工艺。
背景技术：
1、近些年来，随着我国的综合实力提升，人民生活条件以及经济水平的提高，越来越多人选择有针对性营养品进行身体的调节。其中，骨骼发育与健康的问题已经被大家普遍关注，尤其是儿童青少年和中老年人的骨骼健康。然而现在许多人仅局限于补钙有助于骨骼的健康，而对于如何正确有效的补钙却一无所知。
2、牛乳中主要含有两大类蛋白质：酪蛋白和乳清蛋白。其中，酪蛋白约占牛乳蛋白质的80％左右，是牛乳的主要组成部分，乳清蛋白约占20％。牛奶中不仅含有促进生长发育的营养物质，还有乳糖和酪蛋白磷酸肽等影响骨代谢的生物功能性化合物。这些物质对于预防和治疗骨质疏松症，具有一定的效果。
3、牛初乳是奶牛产仔后的乳汁，作为一种超过50年的营养珍品，其不仅蛋白质含量高，还含有多种影响免疫、生长发育和骨骼健康的成分，包括免疫球蛋白、乳铁蛋白、初乳碱性蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、生长因子、低聚糖等。其中初乳碱性蛋白是近期国际上成功提取的极具应用价值的初乳精华，相较于成熟牛奶，牛初乳中的初乳碱性蛋白含量更高。
4、初乳碱性蛋白为一类活性蛋白，在牛初乳中含量仅为0.04％，普通的牛乳中也含有少量的初乳碱性蛋白，含量大约在0.015％左右。经研究表明，初乳碱性蛋白是分子质量约为1～30kda的活性蛋白，可直接作用于骨细胞，具有促进骨细胞增殖，极大加强钙质的吸收作用，与钙结合能有效增加人体骨密度以及儿童青少年的骨骼发育。它一旦被吸收就能促进骨骼生长，且热处理和消化酶作用不会破坏其功能。因此初乳碱性蛋白可以有效预防骨质疏松症。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种初乳碱性蛋白的制备工艺，以解决现有技术中存在的问题。
2、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
3、一种初乳碱性蛋白的制备工艺，主要包括以下制备步骤：脱脂除酪蛋白、酶解、等电点沉淀、一次超滤、二次超滤、纯化、杀菌和冻干；
4、所述酶解使用磁性固定化胃蛋白酶进行；
5、所述一次超滤使用截留分子量30kda的超滤膜错流进行；
6、所述二次超滤使用截留分子量1kda的超滤膜错流进行；
7、所述纯化使用阳离子交换树脂进行吸附和洗脱；
8、所述磁性固定化胃蛋白酶是将胃蛋白酶固定在改性硅壳磁性纳米粒子上制得；
9、所述改性硅壳磁性纳米粒子是依次用正硅酸四乙酯、3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷对磁性四氧化三铁纳米粒子进行改性制得。
10、作为优化，所述初乳碱性蛋白的制备工艺主要包括以下步骤：
11、(1)脱脂除酪蛋白：将新鲜牛初乳在4000～5000rpm，4℃离心15～20min，弃去上层脂肪，清液用1mol/l盐酸水溶液调节ph至4.6，静置30～40min，在4000～5000rpm，4℃离心15～20min，过滤得乳清液；
12、(2)酶解：将乳清液用2mol/l的盐酸水溶液调整ph至2.0，在37℃水浴10～12min，按磁性固定化胃蛋白酶、乳清液质量比1:(20～25)加入磁性固定化胃蛋白酶，在37℃恒温水浴，150～200r/min酶解1.5～2h，外加磁场分离磁性固定化胃蛋白酶，得到乳清酶解液；
13、(3)等电点沉淀：将乳清酶解液用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至4.8，在60℃水浴70～80min，4000～5000rpm离心25～30min，取上清液，得到乳清分离液；
14、(4)一次超滤：将乳清分离液使用截留分子量30kda的超滤膜进行错流超滤，条件为：错流流速6～7l/min，压力0.45～0.55mpa，期间进行补水，得到乳清超滤滤过液；
15、(5)二次超滤：将乳清超滤滤过液用截留分子量1kda的超滤膜进行错流超滤，条件为：错流流速6～7l/min，压力0.75～0.85mpa，浓缩乳清超滤滤过液体积至原有的4.4％～5.3％，得到乳清超滤截留液；
16、(6)纯化：将乳清超滤截留液按1.5～2ml/min的速度泵入阳离子交换树脂柱中，在40℃，使用0.05mol/l的ph为7.0的磷酸盐缓冲液以2.4～2.6ml/min进行洗脱，洗脱至检测不到蛋白质为止，得洗脱液，将洗脱液用截留分子量1kda的超滤膜进行错流超滤，条件为：错流流速6～7l/min，压力0.75～0.85mpa，浓缩至原有体积的2％～3％，取截留液，得到乳清浓缩液；
17、(7)杀菌和冻干：将乳清浓缩液置于高压脉冲电场中，在5～10℃下处理15～20s，真空冷冻干燥16～20h，制得初乳碱性蛋白。
18、作为优化，步骤(2)所述磁性固定化胃蛋白酶的制备方法包括以下制备步骤：
19、(a)按质量份数计，将0.5～0.6份磁性四氧化三铁纳米粒子、3～4份2.7mol/l氨水、40～60份乙醇、10～15份纯水混合均匀，超声分散50～60min，以1～2滴每秒滴加0.8～1.2份正硅酸四乙酯，在室温下，200～300r/min搅拌5～6h，静置2～3h，外加磁场分离，用纯水洗涤至中性，再用无水乙醇和乙醚各洗涤3～4次，在60～80℃真空干燥10～12h，制得硅壳磁性纳米粒子；
20、(b)将硅壳磁性纳米粒子、3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷、乙醇按质量比1:0.4:10混合均匀，在室温下，超声30～40min，再静置1～1.5h，外加磁场分离，在30～40℃真空干燥20～30min，在40℃水气氛中密闭30～40min，在60～70℃烘箱中静置12～14h，用乙醇洗涤3～4次，在40～50℃真空干燥3～4h，制得改性硅壳磁性纳米粒子；
21、(c)将1mg/ml的胃蛋白酶缓冲溶液、改性硅壳磁性纳米粒子按质量比1:(0.1～0.2)混合均匀，在ph为4，恒温水浴15～25℃，150～200r/min搅拌反应8～10h，外加磁场分离，用去离子水洗涤5～6次，在15～20℃真空干燥8～10h，制得磁性固定化胃蛋白酶。
22、作为优化，步骤(4)所述补水为每收集乳清分离液体积三分之一的滤过液补充1次等体积的纯水，一共补充12～15次。
23、作为优化，步骤(6)所述阳离子交换树脂是d72、d61、d81、d113、d001、001×7中的一种。
24、作为优化，步骤(7)所述高压脉冲电场的场强为30～50kv/cm，脉冲频率为200～400hz。
25、作为优化，步骤(a)所述磁性四氧化三铁纳米粒子粒径为15～20nm。
26、与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
27、本发明在制备初乳碱性蛋白时，先依次使用正硅酸四乙酯、3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷对磁性四氧化三铁纳米粒子进行改性制得改性硅壳磁性纳米粒子；将胃蛋白酶固定在改性硅壳磁性纳米粒子上制得磁性固定化胃蛋白酶；将牛初乳经脱脂除酪蛋白、酶解、等电点沉淀、一次超滤、二次超滤、纯化、杀菌和冻干的步骤从牛初乳中分离提纯出初乳碱性蛋白。
28、首先，利用正硅酸四乙酯对磁性四氧化三铁纳米粒子进行改性，使其表面包覆一层二氧化硅层，用以保护内部磁性四氧化三铁纳米粒子不受酸碱、空气腐蚀，随后使用3-(2,3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷继续改性，向纳米粒子表面引入环氧基团，随后胃蛋白酶与环氧基团发生共价键反应，从而将胃蛋白酶固定于其上，得到磁性固定化胃蛋白酶。
29、其次，牛初乳经过离心脱脂与等电点沉淀除去酪蛋白之后，即得到主要含有乳清蛋白的乳清液，随后使用磁性固定化胃蛋白酶对乳清液进行酶解，预实验表明此条件下胃蛋白酶主要对乳清蛋白中的α-乳白蛋白进行酶解，随后使用等电点沉淀法除去β-乳球蛋白，牛初乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白为主要致敏来源，本法将这两种蛋白除去以降低初乳碱性蛋白的致敏性；随后先使用截留分子量30kda的超滤膜进行一次超滤，再使用截留分子量1kda的超滤膜进行二次超滤，两次超滤均使用错流法进行，减少膜污染，一次超滤收集滤过液，除去乳清蛋白中大于30kda的大分子蛋白，随后在二次超滤中收集截留液，除去小于1kda的小分子氨基酸、无机盐、短肽链等，并同时对乳清液进行浓缩，二次超滤的滤过液因含有α-乳白蛋白被酶解后的大量短肽链与氨基酸，也可以继续回收提取进行利用。
30、最后，使用阳离子交换树脂对乳清超滤截留液中的初乳碱性蛋白进行吸附，吸附完全后使用缓冲液进行洗脱，利用阳离子交换树脂对碱性蛋白的特异性吸附将初乳碱性蛋白分离出来，并且由于已经将牛初乳中的其他组分进行分离，初乳碱性蛋白相当于已被浓缩富集，变相提高了阳离子交换树脂的分离效率；将洗脱液再使用截留分子量1kda的超滤膜超滤一次，以除去其中的小分子无机盐，并浓缩得到乳清浓缩液；使用高压脉冲电场可以有效杀菌并降低蛋白质变性的概率。
1.一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，主要包括以下制备步骤：脱脂除酪蛋白、酶解、等电点沉淀、一次超滤、二次超滤、纯化、杀菌和冻干；
2.根据权利要求1所述的一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，所述初乳碱性蛋白的制备工艺主要包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)所述磁性固定化胃蛋白酶的制备方法包括以下制备步骤：
4.根据权利要求2所述的一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(4)所述补水为每收集乳清分离液体积三分之一的滤过液补充1次等体积的纯水，一共补充12～15次。
5.根据权利要求2所述的一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(6)所述阳离子交换树脂是d72、d61、d81、d113、d001、001×7中的一种。
6.根据权利要求2所述的一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(7)所述高压脉冲电场的场强为30～50kv/cm，脉冲频率为200～400hz。
7.根据权利要求3所述的一种初乳碱性蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(a)所述磁性四氧化三铁纳米粒子粒径为15～20nm。
